分析化學發光/魯米諾

B1. 魯米諾

B1a. 概述

魯米諾是 5-氨基-2,3-二氫-1,4-酞嗪二酮（常稱為 3-氨基鄰苯二甲醯肼）的通用名稱。魯米諾的氧化產生激發的 3-氨基鄰苯二甲酸酯，它在弛豫時發射光（λ_max = 425 nm），量子產率約為 0.01； 關於使用魯米諾的危害資訊可在美國國家毒理學計劃的網站上獲得 [1]。該反應由催化過程觸發，通常是酶促過程，例如由含血紅素的蛋白質提供，特別是辣根過氧化物酶（HRP，EC 1.11.1.7）。在過氧化氫的存在下，該酶轉化為中間體複合物，然後再生。它在生物學工作中具有明顯的優勢，允許魯米諾反應在低至 8.0 到 8.5 的 pH 值下進行。HRP 可用作標籤來檢測目標分析物，魯米諾化學發光可用於檢測產生過氧化氫的氧化酶的底物。酶催化將在 B1f 部分（新增連結）中全面討論。催化劑可以是化學的而不是酶促的（例如，過渡金屬陽離子或絡離子，例如，高 pH 值下的鐵氰化物）。金屬離子催化將在 B1e 部分（新增連結）中全面討論。

或者，魯米諾化學發光可以透過電化學方式觸發。Sakura 建議魯米諾在電極表面被氧化，然後它可以與過氧化氫反應，每個過氧化氫分子產生一個光子（與 HRP 催化反應中的 0.5 相比），從而實現更靈敏的檢測，並避免酶方法的脆弱性。 魯米諾電化學發光將在 B1d 部分（新增連結）中全面討論。

已經設計了許多測定化合物的分析方法，這些方法透過抑制、增強或催化魯米諾化學發光來進行。檢測限達到亞飛摩爾水平，但化學的通用性限制了它的選擇性。這對體液或天然水等非常複雜的樣品來說是一個嚴重的缺點；在某些情況下，一種分析物可能增強魯米諾反應，而另一種分析物則抑制它，由此產生的訊號是難以解釋的多種效應的組合。在過程分析化學中，情況要容易得多，因為可能只存在一種預期分析物。將化學發光反應與分離步驟（液相色譜或毛細管電泳）（新增連結）後柱聯用可以克服干擾，並提供飛摩爾-皮摩爾檢測限。在分離前用魯米諾標記樣品成分可以達到同樣的目的。選擇性也可以透過將魯米諾反應與酶促反應或抗體檢測或分子印跡聚合物的識別相結合來提供。

已經合成了許多魯米諾的類似物； 其中一些比魯米諾本身產生更強烈的化學發光，但前提是修飾僅限於魯米諾分子的苯環。對雜環的改變會消除化學發光。鄰苯二甲醯肼（沒有胺取代基的魯米諾）除了在非質子溶劑中外，不具有化學發光性。

B1b. 機制

圖 B1.1 - 魯米諾初級氧化的一電子和兩電子途徑導致二級氧化和化學發光。

Roswell 和 White 提出了魯米諾氧化化學發光的機制； 一些單獨的步驟已被 Lind、Merenyi 和 Eriksen 研究。 圖 B1.1 是該機制的流程圖；文中顯示了參與魯米諾氧化的主要化學物質的結構及其縮寫。該模型提出魯米諾二氮雜醌過氧化氫陰離子 (LOOH^–) 的兩步形成，它們自發分解（透過三環內過氧化物過渡態）形成二氮和激發的 3-氨基鄰苯二甲酸酯陰離子，從而發光。透過該途徑的魯米諾氧化量子產率很高，從而獲得良好的分析靈敏度。

b(i) 魯米諾的初級氧化

過氧化氫中間體 (LOOH^–) 是透過魯米諾單陰離子 (LH^–) 的初級氧化形成的，它先被氧化成自由基 (L^•–)，然後加成超氧化物 (O₂^•–)，或者先被氧化成二氮雜醌 (L)，然後加成過氧化氫陰離子 (HO₂^–)。

(a) 魯米諾 (LH₂) 在 pH 值為 10.0 的水溶液中以單陰離子 (LH^–) 的形式存在，它們透過一電子氧化（例如，透過羥基自由基 (HO^•, E⁰ = +2.8 V)）形成二氮雜半醌自由基 (L^•–)，其形成速度很快（k = 9.7 x 10⁻⁹ dm³ mol⁻¹ s⁻¹）

1) LH^– – e^– → LH^• （例如，LH^– + HO^• → L^•– + H₂O）

(b) 魯米諾單陰離子的兩電子氧化（例如，用過氧化氫）生成二氮雜醌 (L)，

2) LH^– – 2e^― → L + H⁺ （例如，LH^– + H₂O₂ → L + H₂O + HO^–）

兩電子氧化在魯米諾-過氧化氫反應開始時發生。在過氧化氫與魯米諾競爭羥基自由基轉化為 HO₂^• 之前，不存在超氧化物，HO₂^• 在高 pH 值下迅速去質子化形成 O₂^•–（pK_a = 4.8）

3) H₂O₂ + HO^• → O₂^•– + H₃O⁺ 羥基自由基與魯米諾反應將單陰離子 (LH^–) 轉化為 L^•– 或 LH^•，具體取決於 pH 值；這是一個單電子氧化過程。第二個電子的轉移形成二氮雜醌，只有在沒有超氧化物的情況下才會發生，否則超氧化物會與 L^•– 或 LH^• 反應形成魯米諾二氮雜醌過氧化氫陰離子 (LOOH^–)。

初級氧化步驟通常決定發光速率，因此魯米諾化學發光實際上測量了氧化劑進行該反應的能力，但其他因素也會影響初級氧化的速率。魯米諾與過氧化氫之間的反應產生的光發射可以由鈷 (II) 的存在誘導，鈷 (II) 的濃度低到可以被認為是催化的，並且有人提出鈷 (II) 過氧化物絡離子可以引起魯米諾的初級氧化。

b(ii) 魯米諾的二級氧化

在分析魯米諾化學發光中，魯米諾的初始氧化是速率決定步驟。但化學發光也取決於超氧化物或過氧化氫離子對二級氧化的可用性。因此，使用脈衝輻射分解進行了實驗以進行初級氧化，從而允許在脈衝之間的停頓時間內研究二級氧化的速率。透過一電子初級氧化形成的質子化的二氮雜半醌自由基 (LH^•) 新增到超氧化物自由基 (O₂^•–) 中，形成二氮雜醌過氧化氫 (LOOH^–)

1) LH^•– + O₂^•– → LOOH^–

此反應消耗超氧化物自由基陰離子，並且在過量過氧化氫存在的情況下，消耗大部分 LH^•。然而，LH^• 也可以自發重組。在沒有超氧化物的情況下，所有魯米諾自由基都透過重組消耗，其中至少 80% 是由二聚化引起的。二氮雜醌 (L) 是魯米諾雙電子初級氧化產物，透過新增氫過氧化物陰離子轉化為過氧化物。

2) L + HO₂^– → LOOH^–

b(iii). 氫過氧化物中間體的分解

二級氧化之後，環狀氫過氧化物中間體分解成 3-氨基苯二甲酸，在弛豫到基態時會發出光。

LOOH^– → 3-氨基苯二甲酸 + N₂ + hν

鹼性過氧化物加合物 (LOOH^–) 分解形成氨基苯二甲酸發射體的激發態，而質子化的加合物則會發生非化學發光的副反應，形成不同的黃色產物，即所謂的“暗反應”。 LOOH^– 的吸收光譜以與發光強度相同的速率衰減。發射強度隨著 pH 值的升高而增加，在 pH 值約為 11 時達到最大值，這反映了 H₂O₂ 越來越多的解離成其陰離子和暗反應的重要性降低。pH 值超過 11 後，光輸出降低反映了發射體熒光量子產率 (Φ_FL) 的降低。

b(iv) 化學發光量子產率的測定

Lind 和 Merényi 已經測量了魯米諾透過放射源產生的羥基自由基發生單電子氧化產生的幾種化學發光反應的光產率。利用從電離粒子到水介質的 100 eV 傳遞，可以透過 Φ_CL = G(hν)/ Φ_CLG_OH 來計算 Φ_CL。他們提出了一種標準，用於透過脈衝輻照引發魯米諾化學發光，該標準由 10⁻³ mol dm⁻³ 的水性魯米諾溶液組成，pH = 10.0，用 10% O₂ 和 90% N₂O 飽和。在定義了具有明確光輸出的標準後，就可以相對於該標準確定任何其他魯米諾反應的化學發光量子產率。Merényi 和 Lind 透過將積分光強度繪製成放射劑量（與羥基自由基濃度呈線性關係）的函式來完成此操作。透過比較圖的斜率獲得光產率，從而獲得相對量子產率。

B1c. 魯米諾化學發光中使用的氧化劑

c(i). 過氧化氫

過氧化氫在分析上是魯米諾最有用的氧化劑，但需要電極、金屬離子或酶的催化作用。例如，它在鈷 (II) 催化劑存在的情況下，在水性介質中很容易與魯米諾反應。該反應是在 0.1 mol dm⁻³ 的碳酸鹽緩衝液 (pH 值在 10 到 11 之間) 中使用等體積的 0.1 mol dm⁻³ 過氧化氫和 1.0 × 10⁻³ mol dm⁻³ 魯米諾溶液進行化學發光的非常有效的臺式演示。一些金屬離子，如鐵 (II)，用於催化魯米諾的氧化，與過氧化氫反應：Fe²⁺ + H₂O₂ → Fe³⁺ + HO^• + HO^– 生成羥基自由基（芬頓反應），羥基自由基具有非常強的氧化效能，因此可以引發魯米諾的初級氧化。但它們也與過氧化氫（方程 1）和氫過氧化物離子（方程 2）反應：1) H₂O₂ + HO^• → O₂^•– + H₃O⁺ 2) HO₂^– + HO^• → O₂^•– + H₂O 這些反應中羥基自由基的消耗降低了初級氧化的速率，但超氧化物的生成增加了二級氧化的速率。

c(ii). 氧氣

魯米諾自由基還原為單陰離子 (LH^• + e⁻ → LH⁻) 的標準還原電位 (E⁰) 已被確定為 +0.87 V。 由分子氧 (E⁰ = 1.229 V) 氧化在熱力學上是可能的，但在水溶液中，反應活性在任何 pH 值下都不可檢測 (k = 10⁻⁸ dm³ mol⁻¹ s⁻¹)，因此該反應不適用於初級氧化。人們普遍認為，即使在 pH = 14 時，空氣飽和的魯米諾溶液在黑暗中也是無限期穩定的。儘管如此，溶解在水溶液中的氧氣氧化魯米諾的現象經常被報道。在這種情況下，可能是指由氧自由基氧化，氧自由基可能是由合適的還原劑（如金屬離子）從分子氧中形成的。這種現象在第 D10 章中討論，以及其他氧自由基作為化學發光試劑的情況（連結）。

在二甲基亞碸 (DMSO) 溶液中，魯米諾以二陰離子的形式存在，並在強鹼存在的情況下與溶解的氧氣反應，產生強烈的化學發光。 該反應的速率常數約為 50 dm³mol⁻¹s⁻¹； 氧氣與魯米諾二陰離子在鹼性水溶液中發生類似反應的速率常數為 10⁻² dm³ mol⁻¹ s⁻¹。由於在 DMSO 溶液中反應條件相對簡單，這種現象作為演示得到了廣泛的認可， 因為在室溫下搖晃一瓶鹼性 DMSO 中的少量魯米諾就會發生反應。然而，雖然魯米諾在水溶液中的氧化在分析中得到非常廣泛的應用，但還沒有使用 DMSO、二甲基甲醯胺或其他有機溶劑中的反應建立的分析程式，但已經研究了各種金屬配合物對 DMSO 中反應的影響 發射體（3-氨基苯二甲酸離子）在非質子溶劑（如 DMSO）中互變異構為醌式結構，在 510 nm 處發出最大發射；這種互變異構體受魯米諾陰離子與金屬陽離子（如 Na⁺ 或 K⁺）配對的青睞。如果魯米諾在混合溶劑中氧化，與水性介質相比，在 425 nm 處發射較少（離子對減少），在 510 nm 處發射更多。同樣在混合溶劑中，化學發光中 425 nm 的發射比熒光中的發射少，因為在化學發光中，離子對的比例由過渡態決定，而不是由熒光中基態平衡決定。

c(iii). 錳的高氧化態

高錳酸根離子在熱力學上很容易氧化魯米諾 (E⁰ = 1.70 V)。已經報道了一種基於抑制魯米諾-高錳酸鹽化學發光的對乙醯氨基酚在藥物製劑中的流動注射分析方法。 早些時候，人們製造了一種新穎的尿素生物感測器，其中脲酶催化水解產生的碳酸銨被用來從陰離子交換柱中釋放魯米諾，然後與從第二個柱中洗脫的高錳酸鹽反應，產生化學發光。 隨後，魯米諾-高錳酸鹽體系的許多新應用不斷湧現。

在鹼性高錳酸鉀的作用下，魯米諾被氧化生成錳酸根離子（VI），錳酸根離子進一步與魯米諾反應產生化學發光。這種現象被作者稱為“二次化學發光（SCL）”，並已應用於鎳（II）離子的測定方法中。 在合適的流動注射系統中，將稀鹼性魯米諾溶液與水溶性高錳酸鉀溶液混合，並使其反應足夠長的時間，使產生的化學發光下降至接近於零的穩定最小值。然後將樣品注入混合物中，如果存在鎳離子，則光發射會重新開始並迅速上升至一個明確的峰值，然後恢復到基線強度。透過使用十倍過量的魯米諾（超過高錳酸鉀）在 0.1 mol dm⁻³ 的水溶性氫氧化鈉溶液中並以 pH 5.10 注入樣品，可以獲得最佳的二次化學發光強度；建立了與鎳（II）濃度的線性關係，檢測限為 0.33 μg dm⁻³。發現許多二價和三價金屬離子以及硝酸根離子會干擾測定。魯米諾-錳酸根（VI）化學發光的機理似乎與其他魯米諾氧化反應相同，其中產生激發的 3-氨基鄰苯二甲酸根離子，在 425 nm 處發射光。但高錳酸鹽和錳酸根（VI）的氧化都可能導致激發的錳（II）的形成，這將是化學發光的另一個來源。不幸的是，在所描述的工作中，化學發光光譜僅觀察到 490 nm，忽略了這些可能對訊號的貢獻。

c(iv) 銀(III)

一種相當穩定的銀(III) 絡陰離子，二過碘酸銀(III) (DPA)，[Ag (H₂IO₆)(OH)₂]²⁻，可以很容易地合成。 在鹼性水溶液中觀察到魯米諾與二過碘酸銀之間的新的化學發光反應。 該反應發光被鐵奈米粒子強烈增強，加入氨茶鹼後發光強度進一步增強。 這構成了測定方法的基礎，在該方法中，化學發光訊號與人血清中氨茶鹼濃度在 1.0 x 10⁻⁸ 到 2.0 x 10⁻⁶ mol dm⁻³ 範圍內呈線性關係。檢測限為 9.8 x 10⁻⁹ mol dm⁻³。在 8.0 x 10⁻⁷ mol dm⁻³ 時的相對標準偏差為 4.8% (n = 10)。

青黴素類抗生素也被發現能增強魯米諾-銀(III) 絡合物的化學發光，這構成了用於藥物劑型和尿液樣品中這些藥物的靈敏流動注射測定方法的基礎。在最佳化的條件下，苯唑西林鈉的檢測限為 70 ng cm⁻³，阿莫西林的檢測限為 67 ng cm⁻³，氨苄西林的檢測限為 169 ng cm⁻³，克羅西林鈉的檢測限為 64 ng cm⁻³。

發射光線的最大波長約為 425 nm， 這是由魯米諾氧化產生的激發的 3-氨基鄰苯二甲酸鹽通常產生的化學發光。這意味著銀(III) 絡合物能夠實現 Shi 等人提出的魯米諾的一級和二級氧化，他們推測每個二過碘酸銀對兩個魯米諾分子進行單電子一級氧化。也許一個魯米諾分子進行雙電子氧化更可能。二過碘酸銀(III) 離子的還原電位為 +1.74 V， 足夠高，可以進行雙電子氧化，將水轉化為過氧化氫 (ε⁰ = -1.763 V；能斯特方程表明過氧化氫的平衡濃度為毫摩爾)。這為二級氧化和一級氧化提供了一種可能的機制。

B1d. 電化學發光

電化學發光 (ECL) 的儀器在 D7 章中介紹。由此產生的反應途徑適合透過改變施加的電壓或選擇的電極來控制發射，並且適用於接近中性 (pH 8.0 到 8.5) 的水溶液，如生物液體，而魯米諾化學發光通常在強鹼性或非水溶液中發生。有人提出，魯米諾首先在電極表面被氧化，然後與過氧化氫反應，化學發光量子產率（參見 A1 章 ADD LINK）得到增強。 早期應用的典型例子是使用玻璃碳電極在 ECL 條件下測定脂質氫過氧化物。 在施加 0.5-1.0 V 的電壓下，魯米諾單陰離子失去一個電子生成二氮雜半醌，二氮雜半醌歧化生成二氮雜醌，二氮雜醌與分析物定量反應。在施加 1.0 V 以上的電壓下，二氮雜醌的 –NH2 和分析物本身都被氧化，分別生成 –NH• 和超氧化物，這會導致干擾訊號。在最佳化的條件下，檢測限為 0.3 nmol，S/N = 1.5。在施加於鉑電極的 0.5-1.0 V 電壓下，亞油酸甲酯氫過氧化物 (MLHP) 和魯米諾都被氧化；MLHP 的檢測限為 0.1 nmol，S/N = 2.5。與之密切相關的亞油酸羥基十八碳二烯酸甲酯（亞油酸氫過氧化物的還原產物）沒有發射。抑制魯米諾氧化的 ECL 訊號可以用作測定抑制劑的方法。最近的一個例子是在乳製品和餐具中測定三聚氰胺。 在高 pH 值的磷酸鹽緩衝液中使用低電壓掃描速率，在 1.47 V 處觀察到 ECL，並且 ECL 線性（r²=0.9911）下降，與三聚氰胺濃度的對數成正比，範圍為 1 到 100 ng cm⁻³。檢測限為 0.1 ng cm⁻³，回收率高。訊號來自活性氧（來自羥基離子的電氧化）與魯米諾的反應，而活性氧被三聚氰胺消除。電極的修飾現在是控制 ECL 的一種成熟方法，近年來，使用奈米材料進行這種修飾變得越來越重要。一個涉及魯米諾的例子是用多壁碳奈米管和全氟磺酸聚合物 Nafion 的複合材料修飾金電極。 在碳酸鹽緩衝液中進行迴圈伏安法時，獲得了三個 ECL 峰，其強度比未修飾電極高 20 倍；在每種情況下，發射體都被確定為 3-氨基鄰苯二甲酸根陰離子，表明這種改進是由於電極效率而不是系統化學的任何變化。

已經制造出 ECL 免疫感測器，已成功應用於測定血清中人免疫球蛋白 G (hIgG)。將主要抗體，生物素偶聯山羊抗人 IgG，首先固定在用鏈黴親和素包覆的金奈米粒子 (AuNPs) 修飾的電極上。感測器是由 hIgG 與標記有魯米諾功能化 AuNPs 的第二抗體偶聯形成的夾心型免疫複合物。ECL 由碳酸鹽緩衝液（含有 1.0 mmol dm⁻³ 過氧化氫）中的雙電位階躍產生。許多魯米諾分子附著在每個 AuNP 的表面，並作為每個抗體分子多個光發射源。這種方式的 ECL 放大與透過生物素-鏈黴親和素系統連線的分析物相結合，導致訊號大大增強。檢測限為 1 pg cm⁻³ (S/N = 3)，超過了所有先前 hIgG 測定方法的效能。

透過在玻璃碳電極表面上製備 L-半胱氨酸還原氧化石墨烯複合材料，並在其上自組裝 AuNPs，對玻璃碳電極表面進行修飾。隨後將膽固醇氧化酶 (ChOx) 吸附在 AuNP 表面，形成具有令人滿意的重現性、穩定性和選擇性的膽固醇生物感測器。AuNPs 增加了電極的表面積，因此允許更高的 ChOx 負載，並提供更有利於 ECL 的奈米結構，從而提高分析效能。感測器的膽固醇線性響應範圍為 3.3 x 10⁻⁶ 到 1.0 x 10⁻³ mol dm⁻³，檢測限為 1.1 x 10⁻⁶ (S/N = 3)。

透過在絲網印刷金電極上電聚合製造的聚（魯米諾-3,3',5,5'-四甲基聯苯胺）共聚物大大提高了過氧化氫的 ECL。透過將膽固醇氧化酶固定在聚合物上，製造出適合分析血清樣品的膽固醇生物感測器。在最佳化的條件下，生物感測器具有 2.4 x 10⁻⁵ 到 1.0 x 10⁻³ mol dm⁻³ 的線性動態範圍，檢測限為 7.3 x 10⁻⁶ mol dm⁻³。精度（以相對標準偏差衡量）在 5.0 x 10⁻⁴ mol dm⁻³ 時為 10.3%，該方法還具有成本低、速度快的優點。