生物實驗室技術/細胞分離

細胞分離

目的

細胞分離是一種標準程式，用於根據細胞在離心機中不同的分離方式來分離亞細胞器。細胞器在離心機中根據密度、形狀和大小分離。細胞核通常是第一個在離心機中沉澱的細胞器。

細胞分離中最重要的裝置是離心機。離心機是一種高速旋轉的裝置，對旋轉的物體施加向心力。離心機中的所有粒子都會感受到相同的力，但密度較大的粒子會在液體中移動得更快，並以比密度較低的粒子更小的力沉澱下來。

離心加速度（或向心加速度）通常用重力加速度的倍數表示。例如，如果離心機施加的力與重力施加的力相同，則表示為 1 G。如果它施加的力是重力的 10 倍，則表示為 10 G。相對離心加速度（通常稱為相對離心力）可以使用公式 RCF= (r X RPM² X (2π)² * (100/36))/(1000² X g) 計算，其中

• r = 樣品距離心機中心的半徑，以釐米為單位
• RPM = 每分鐘轉數
• g = 重力常數 (9.8 m/s²)

此公式通常簡化為 RCF = 11.19 X r X (RPM/1000)²

如果您的離心機無法獲得指定的 RCF，則可以透過更長時間離心來彌補。例如，如果一個程式要求以 10,000G 的 RCF 離心 60 秒，但您的離心機只能獲得 9,000 G，則可以透過離心 67 秒來彌補。確定所需補償時間的公式為：t_r = (t_s X RCF_s)/RCF_max，其中

• t_r = 您離心機所需的時間
• t_s = 說明書中規定的時間
• RCF_s = 說明書中規定的 RCF
• RCF_max = 您的離心機可以獲得的最大 RCF

差速沉降

細胞器的分離是可能的，因為粒子往往以不同的速率沉降。有幾個因素決定沉降速率。

• 密度：在所有其他條件相同的情況下，粒子密度越大，沉降速度越快。然而，如果粒子的密度與樣品中液體的密度相同，則它根本不會沉降。但是，如果粒子比液體介質密度低（例如，油脂和脂類放置在水中時），它會移動到介質的頂部。
• 尺寸：在所有其他條件相同的情況下，粒子越大，沉降速度越快。如果兩塊尺寸不同但密度相同的岩石從船上掉下來，較大的岩石往往會更快沉沒。這是因為有更多的質量（假設密度相同）可以受到重力的作用。較大的質量更容易克服水的摩擦並更快下沉。這並不意味著重力對不同的質量作用不同。這只是另一種描述它所經過的介質作用的方式。一根羽毛會比一袋羽毛掉得慢。然而，在真空中，它們會以相同的速度下落。
• 粘度：液體介質的粘度（或厚度）會減緩沉降速度。如果兩個粒子的尺寸和密度比較接近，並且只有很小的差異，則可以透過增加液體介質的粘度來將它們分離。

此過程允許分離細胞核、線粒體和細胞膜。

所需 材料

試劑

分離緩衝液

• 250 mM 蔗糖（約 4.28g 在 50 mL 中）
• 20 mM HEPES（pH 7.4）
• 10 mM KCl（0.0373 g 在 50 mL 中）
• 1.5 mM MgCl₂
• 1 mM EDTA
• 1mM DTT
• 蛋白酶抑制劑（1X 濃度）

• 注意：僅在使用時新增 DTT 和蛋白酶抑制劑！

實驗室裝置

• (1) 10 釐米培養皿
• (3) 1.5 毫升 Eppendorf 管（管子的確切數量取決於所需的餾分）
• (1) 25 Ga 針頭
• (1) 1 毫升注射器
• (1) 冰塊容器（孵育）
• (1) 一套微量移液器
• (1) 超聲波清洗器
• (1) 離心機，能夠

   --- 720 G (for nuclear fraction) 
   --- 10,000 G (for mitochondrial fraction)
   --- 100,000 G (for cell membrane fraction)