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DChip/實驗設計

來自華夏公益教科書,自由的教學讀物

設計微陣列實驗

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樣本隨機化

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為了最大程度地減少實驗差異,最好由同一個人在同一個微陣列核心設施中執行所有實驗。但是,如果實驗涉及許多樣本,我們必須在不同的日子進行。在不同日子產生的陣列可能存在“批次差異”,因為使用了不同的試劑來擴增和標記樣本。這可以透過無監督聚類來檢測。雖然“陣列列表檔案”可以用來緩解這種情況,但在進行實驗之前最好考慮這些影響。例如,如果實驗比較兩種條件,每種條件有多個樣本,最好不要將條件 A 的所有樣本在一天內進行擴增和雜交,而將條件 B 的所有樣本在另一天進行。在這種情況下,即使發生批次效應,我們也無法確定,因為它們與我們感興趣的真實生物變異混合在一起。因此,更合理的做法是考慮一個均衡的設計,其中所有條件的樣本隨機分佈在不同的樣本擴增和雜交日。

重複樣本

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另一種減少實驗差異的方法是重複樣本。如果在複製點之後的實驗或分析步驟中以無偏的方式引入差異,則對最終表達值進行平均可以更好地估計複製點的“表達水平”(平均值的方差與複製次數成反比)。複製可以在以下粗略的尺度上從早期到晚期進行:不同個體(細胞系菌株)、獨立培養的細胞系(純系動物)、來自同一​​個體的不同組織樣本、分裂組織樣本、分裂mRNA、分裂IVT以及多次掃描一個陣列。我們觀察到,在IVT分裂水平上的複製通常在表達值方面非常一致,並且聚類非常緊密。因此,這種複製可能無法幫助我們更好地估計和減少在IVT分裂點之前引入的差異。

複製點的實際選擇應該適合實驗目的。例如,當研究者只有非常少量的RNA時,可以選擇使用雙輪擴增(這可能存在5'偏差)或將來自同一窩的不同動物的RNA彙集在一起。只要彙集的動物之間的基因表達變異預計小於研究的生物條件之間的基因表達差異,彙集更多樣本是好的,但這項選擇可能更昂貴。即使樣本量足夠,也存在選擇是否要處理每個動物的樣本並將其雜交到不同的陣列上,或者先彙集不同動物的樣本,然後將彙集的樣本分成幾個等份,分別進行IVT和雜交到重複陣列上。這種情況更加複雜,答案可能取決於具體的實驗(複製次數、複製和彙集的點,以及這些點上的基因變異)。

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