普通生物學/遺傳學/重組DNA技術
普通生物學 | 入門 | 細胞 | 遺傳學 | 分類 | 進化 | 組織和系統 | 補充材料
- 徹底改變了現代生物學
- 體外操縱基因的能力
- 雜合基因，包括組合不同物種的基因
- 對基因功能的詳細研究
- 確定基因及其調節因子的核苷酸序列（推斷蛋白質的氨基酸序列）
- 基因組計劃：超過 40 個基因組的完整核苷酸序列，包括人類基因組
- 由以下因素的匯聚而成為可能
- 限制性內切酶的發現
- 細菌及其質粒的遺傳學
- 用途
- 對基因功能的詳細研究
- 穩態，對壓力的反應
- 發育（出生缺陷）
- 基因的進化反映了生命進化的資訊
- 人類福祉
- 醫學
- 識別和治療遺傳疾病
- 分子醫學：根據推斷的氨基酸序列，設計更好的藥物
- 食品
- 提高作物產量，抗病性
- 改善營養價值
- 法醫
- DNA指紋識別：判定有罪或無罪
最初在細菌中發現，以防止病毒DNA入侵，切割未甲基化的雙鏈DNA，不會切割新合成的DNA，因為它半甲基化，是DNA半保留複製的產物
- 為了結合外源DNA，切斷兩條多核苷酸鏈的磷酸二酯鍵
- 產生限制性片段（限制性消化）
- 末端有5'磷酸和3' –OH
- 通常具有核苷酸特異性靶序列
- 最常見的為4-6個鹼基對，鹼基對越多，重組的特異性就越高
- 在序列中或附近切割
- 末端
- 粘性末端=突出末端，5'或3'
- 平末端-直切，在高連線酶的存在下會與任何其他平末端退火
- 數百種已知的限制性內切酶，通常以發現它們的細菌命名
- 例如 EcoR1、Alu1、BamHI、HindIII
基因克隆
- 克隆
- DNA的限制性消化
- 將限制性片段插入克隆載體中
- 細菌質粒
- 細菌病毒
- 酵母人工染色體
- 用重組質粒或病毒轉化細菌
- 使用報告基因或抗生素暴露後的抗性篩選感興趣的克隆
- 確定核苷酸序列並根據遺傳密碼推斷氨基酸序列
- 提交給GenBank（可在WWW上獲取）
- 操縱基因以研究其功能
- 體外
- 體內
- 轉基因（重組）生物
- 敲除生物
- 醫學和商業用途
- 聚合酶鏈反應（Mullis）
- 無需克隆即可擴增目標DNA
- 目標量可以是單個分子
- 擴增的DNA可以被測序、克隆等
- Southern印跡
- 用於識別攜帶特定基因的限制性片段
- 也用於DNA指紋識別和RFLP分析
- cDNA構建
- 從mRNA模板反轉錄
- 使用SNP（單核苷酸多型性）和DNA序列重複的DNA指紋識別的基礎
- 許多用途
- 使用多個探針的刑事案件
- 親子鑑定
- 物種鑑定
- 基因進化
- 物種進化
- 使用雙脫氧核苷酸（ddNTP）、模板鏈、DNA聚合酶1（也稱為Kornberg酶）和dNTP
- 缺少用於親核攻擊的3'-OH以進行延伸
- 在雙脫氧核苷酸被摻入DNA片段後，DNA合成停止
- ddNTP與dNTP的比例決定終止的可能性
- 使用32P標記的ddATP的手工方法和4個試管-ddATP、ddCTP、ddGTP、ddTTP
- 使用在毛細管中用熒光染料標記的ddNTP的自動化方法
- 通常在商業上進行
典型機器
- 2小時測序執行
- 每個樣本600-1000個鹼基
- 多個樣本
- 每天最多500,000個鹼基（12小時）
- 資料由計算機處理
- 在大型實驗室中，測序反應也實現了自動化
- 確定整個基因組的完整核苷酸序列
- 已測序的超過 40 個基因組
- 幽門螺旋桿菌
- 大腸桿菌
- 釀酒酵母
- 秀麗隱杆線蟲
- 果蠅
- 智人（第一個粗略草案）
- 計算機根據基因的特性（例如，起始/終止密碼子、內含子等）識別所有基因。
- DNA片段的微陣列，郵票大小；可能很昂貴，但成本已下降
微陣列晶片包含編碼特定基因的DNA孔，利用與感興趣基因雜交的概念來檢視基因是否表達或是否存在。
- 旨在檢測
- 突變基因（SNP）
- 表達的基因
- 即時DNA圖譜（“GATTACA”）
- 醫學
- 基因替代療法的風險和知情同意
- 人類基因庫的改變
- 父母的選擇
- 隱私
- 轉基因食品
- 安全
- 標籤
- 法醫
- 強制性檢測
- 可靠性標準
- 研究和操控基因的技術被授予專利（例如，克隆和 PCR）。
- 基因應該被授予專利嗎？
- 它們是發現者的智慧財產權嗎？
- 它們不屬於我們所有人嗎？
- 土著人民是否應該因從他們當地的植物和真菌中提取的有用基因獲得補償？
- 來自早期胚胎的全能細胞
- 可以生長成任何組織或細胞型別
- 可以引入重組基因
- 在分析小鼠基因表達方面有相當大的應用
- 可能在人類中用於治療
- 非常有爭議
本文件基於克利夫蘭州立大學的 Paul Doerder 博士慷慨捐贈的筆記。