生命科學方法與概念/瓊脂糖凝膠電泳
瓊脂糖凝膠電泳用於根據核酸的長度分離核酸。透過施加電場，帶負電荷的核酸在瓊脂糖基質中移動。分子的遷移率與其長度的對數成反比，這意味著小的 DNA 或 RNA 片段比大的片段遷移得更快。
分離後，核酸被染色，然後可以在紫外線下觀察。透過將遷移距離與 DNA 大小標記進行比較，可以估計片段的大小。為了在進一步的程式中使用，可以從凝膠中提取片段。
瓊脂糖是一種多糖聚合物材料，通常從海藻中提取。它是一種線性聚合物，由透過 α-(1→3) 和 β-(1→4) 糖苷鍵連線的交替的 D-半乳糖和 3,6-脫水-L-半乳糖吡喃糖組成。
每個瓊脂糖鏈約包含 800 個單體，並且瓊脂糖聚合物鍊形成螺旋纖維，這些纖維聚集形成超螺旋結構。當凝固時，纖維形成直徑範圍為 50 奈米至 >200 奈米的通道的三維網格，具體取決於所用瓊脂糖的濃度。3-D 結構透過氫鍵保持在一起，因此可以透過加熱迴流至液態而破壞。
瓊脂糖通常以 0.5 到 2% (w/v) 的濃度使用。應根據預期片段的大小調整濃度。對於小片段，在高瓊脂糖濃度下解析度更好，而較低的濃度有助於分離大分子。可以從下表中獲取建議。
| 瓊脂糖濃度為 %(w/v) | 線性 DNA 的有效分離範圍 |
對於小核酸（10-1000 bp），可以使用濃度為 2-4% 的篩分瓊脂糖。標準瓊脂糖的凝膠溫度為 35-42 °C，熔化溫度為 85-95 °C。瓊脂糖可以透過羥乙基化進行修飾，這種取代減少了鏈內氫鍵的數量，導致熔化和凝固溫度低於標準瓊脂糖。確切的溫度由取代程度決定，許多可用的低熔點 (LMP) 瓊脂糖型別可以在 30-35 °C 下保持液態。這種特性允許透過將包含感興趣 DNA 的熔化凝膠片直接新增到反應混合物中來進行酶促操作。
瓊脂糖聚合物含有帶電荷的基團，特別是丙酮酸和硫酸鹽。這些帶負電荷的基團在稱為電滲流 (EEO) 的過程中產生與 DNA 運動方向相反的水流，因此會阻礙 DNA 的運動並導致條帶模糊。較高的凝膠濃度會導致較高的電滲流。因此，低 EEO 瓊脂糖通常更適合用於核酸的瓊脂糖凝膠電泳，但高 EEO 瓊脂糖可用於其他用途。
透過將瓊脂糖粉末溶解在合適的緩衝液（如用於電泳的 TAE 或 TBE）中來製備凝膠。在加熱到接近沸點之前，將瓊脂糖分散在緩衝液中。將熔化的瓊脂糖充分冷卻後，才能將溶液倒入鑄模中，因為如果瓊脂糖溶液太熱，鑄模可能會變形或破裂。將梳子放置在鑄模中以形成用於載入樣品的孔，並且凝膠應在使用前完全凝固。
凝膠凝固後，取出梳子，留下可以載入 DNA 樣品的孔。在載入之前，將樣品與載入緩衝液混合，載入緩衝液包含緻密的化合物，例如甘油或蔗糖。這會提高樣品的密度，使 DNA 能夠沉到底部的孔中。載入緩衝液還包括有色染料，如溴酚藍和二甲苯氰醇，用於監測電泳的進展。溴酚藍的遷移速度類似於 200 bp 片段，而二甲苯氰醇的遷移速度為 4000 bp。溴酚藍也是一種 pH 指示劑：如果它變成黃色，則緩衝液或凝膠不再是鹼性的，應該更換。
在電泳過程中，板狀凝膠完全浸沒在緩衝液中。這種執行緩衝液與用於凝膠的緩衝液相同。最常見的型別是 Tris/醋酸鹽/EDTA (TAE) 和 Tris/硼酸鹽/EDTA (TBE)。TAE 的緩衝能力低，但它為更大的 DNA 提供最佳解析度，並且不會干擾 DNA 的進一步處理。此外，它可以作為 50x 儲備液儲存，而 TBE 即使在低濃度下也會容易沉澱。硼酸鹽也存在問題，因為 DNA 無法進一步使用，但是，TBE 的緩衝能力強。
在緩衝液中加入 EDTA 是為了失活需要二價陽離子才能發揮作用的核酸酶。
DNA 和 RNA 通常透過用溴化乙錠染色來觀察，溴化乙錠插入 DNA 的鹼基之間。當暴露於紫外線下時，它會發出橙色熒光（605 奈米）。與 DNA 結合後，熒光強度急劇增加，這被認為是由於鹼基對之間的疏水環境造成的，因為水是一種高效的熒光猝滅劑。溴化乙錠可以在瓊脂糖溶液凝固之前加入，或者可以在電泳後對 DNA 凝膠進行染色。無需脫色凝膠，但可能會產生更好的影像。溴化乙錠的檢測限約為每條帶 5 ng DNA。
還有其他染色方法可用；例如，GelRed、SYBR Green、亞甲藍、亮甲酚藍、尼羅藍硫酸鹽和結晶紫。GelRed、SYBR Green 和其他類似的商業產品被銷售為溴化乙錠的更安全替代品，因為溴化乙錠已被證明在 Ames 試驗中具有致突變性，儘管溴化乙錠的致癌性尚未真正確定。
GelRed 在結構上與溴化乙錠密切相關：它由兩個透過線性間隔物連線的乙錠亞基組成。該物質被推銷為比溴化乙錠更靈敏（每條帶 0.1 ng DNA）。SYBR Green 需要使用藍光透射儀。用結晶紫染色的 DNA 可以自然光下觀察，無需使用 UV 透射儀，這是一個優勢，但是它可能不會產生強烈的條帶。
用溴化乙錠染色時，用紫外 (UV) 透射儀觀察凝膠。標準透射儀使用 302/312 奈米 (UV-B) 的波長，但是將 DNA 暴露於 UV 輻射僅僅 45 秒就會對 DNA 造成損傷並影響後續程式，例如降低轉化、體外轉錄和 PCR 的效率。因此，應限制 DNA 暴露於 UV 輻射的時間。使用 365 奈米（UV-A 範圍）的更高波長會對 DNA 造成較少的損傷，但也會產生更弱的溴化乙錠熒光。如果透射儀可以選擇多種波長，則應使用較短的波長捕獲影像，而當需要長時間處理凝膠時，應使用較長的波長。
凝膠電泳後，DNA片段通常從凝膠中分離出來，用於進一步的操作。第一步是識別所需的條帶並將其移除，例如使用刀片。這應該快速進行，以避免DNA因紫外線照射而損壞。從這些條帶中分離和純化DNA的方法有很多，一種常見的方法是使用試劑盒，這些試劑盒可從不同的製造商處獲得。這些試劑盒中包含的方案通常要求將凝膠切片溶解在 3 倍體積的變性劑中，在 50 °C 下進行，然後將溶液應用於離心柱（DNA 保留在柱中），用 70% 乙醇洗滌（DNA 保留在柱中，鹽和雜質被洗掉），最後用少量（30 µL）的水或緩衝液洗脫 DNA。