生命科學方法與概念/色譜法
色譜法是用於分離混合物的一組實驗室技術的總稱。混合物溶解在稱為流動相的流體中，流動相將其透過包含另一種稱為固定相的物質的結構。混合物的各種成分以不同的速度移動，導致它們分離。分離基於流動相和固定相之間的差異分配。化合物分配係數的細微差異會導致固定相上的差異保留，從而改變分離。
色譜法可以是製備性的或分析性的。製備色譜法的目的是分離混合物的成分以供進一步使用（因此是純化的一種形式）。分析色譜法通常使用少量材料進行，用於測量混合物中分析物的相對比例。兩者並不互斥。
離子交換色譜法（通常稱為離子色譜法）根據分析物的電荷進行分離。它使用帶電的固定相來分離帶電的化合物，包括陰離子、陽離子、氨基酸、肽和蛋白質。在傳統方法中，固定相是離子交換樹脂，它帶有帶電的功能基團，這些功能基團與化合物的帶相反電荷基團相互作用以保留。離子交換色譜法通常用於使用FPLC純化蛋白質。
蛋白質具有許多功能基團，這些基團可以帶正電荷或負電荷。離子交換色譜法根據蛋白質的淨電荷進行分離，淨電荷取決於流動相的組成。透過調節流動相的pH值或離子濃度，可以分離各種蛋白質分子。例如，如果蛋白質在pH 7時具有淨正電荷，那麼它將結合到帶負電荷珠的柱上，而帶負電荷的蛋白質則不會。透過改變pH值使蛋白質的淨電荷為負，它也會被洗脫出來。
透過增加流動相的離子強度進行洗脫是一種更微妙的效果——它的作用是流動相中的離子將優先與固定相上的固定離子相互作用。這將“遮蔽”固定相與蛋白質（反之亦然），並允許蛋白質洗脫。
可以根據蛋白質的天然等電點進行分離。或者，可以將肽標籤基因新增到蛋白質中，使蛋白質的等電點偏離大多數天然蛋白質（例如，6 個精氨酸用於結合到陽離子交換樹脂，如 DEAE-Sepharose，或 6 個穀氨酸用於結合到陰離子交換樹脂）。
體積排阻色譜法 (SEC) 根據分子大小（更準確地說是根據其流體力學直徑或流體力學體積）分離分子。較小的分子能夠進入介質的孔隙，因此，分子被捕獲並從流動相的流動中去除。孔隙中的平均停留時間取決於分析物分子的有效大小。但是，大於填料平均孔徑的分子會被排除在外，因此基本上不會被保留；此類物質是第一個被洗脫出來的。它通常是一種低解析度色譜技術，因此它通常保留用於純化的最後一步，即“拋光”步驟。它也用於確定純化蛋白質的三級結構和四級結構，尤其是因為它可以在天然溶液條件下進行。
通常，當使用水溶液將樣品透過柱時，該技術被稱為凝膠過濾色譜法，與凝膠滲透色譜法不同，後者是在使用有機溶劑作為流動相時使用。
凝膠過濾色譜法的主要應用是蛋白質和其他水溶性聚合物的分級分離，而凝膠滲透色譜法用於分析有機溶性聚合物的分子量分佈。這兩種技術都不應與凝膠電泳混淆，凝膠電泳使用電場根據電荷“拉”或“推”分子穿過凝膠。
SEC 的一個要求是分析物不與固定相表面相互作用，分析物之間的洗脫時間差異理想情況下僅基於分析物“看到”的體積。因此，能夠穿透固定相孔系統每個區域的小分子“看到”的總體積等於整個孔體積和顆粒間體積之和。這種小分子將最後洗脫出來（當孔體積和顆粒間體積透過柱子時，大約 80% 的柱體積）。在另一個極端，一個非常大的分子，它不能穿透孔系統的任何區域，只“看到”顆粒間體積（大約 35% 的柱體積），並且將在該體積的流動相透過柱子時更早地洗脫出來。SEC 的基本原理是不同大小的顆粒將在固定相中以不同的速率洗脫（過濾）。這會導致根據大小分離顆粒溶液。只要所有顆粒同時或接近同時載入，相同大小的顆粒應該一起洗脫出來。
然而，由於存在各種衡量大分子大小的方法（例如，回轉半徑和流體力學半徑），SEC 理論中的一個基本問題一直是選擇一個合適的分子大小引數，根據該引數，不同種類的大分子可以被分離。在實驗中，Benoit 及其同事發現洗脫體積與幾種鏈結構和化學成分的動態分子大小（流體力學體積）之間存在極好的相關性。觀察到的基於流體力學體積的相關性被接受為通用 SEC 校準的基礎。
每個體積排阻柱都有一個可以分離的分子量範圍。排除限定義了柱子“工作”範圍上限的分子量，在此分子量處，分子太大而無法被固定相捕獲。範圍的下限由滲透限定義，它定義了能夠穿透固定相所有孔隙的分子量。低於此分子量的所有分子都太小，以至於它們以一個波段洗脫出來。
在末端收集的已過濾溶液被稱為洗脫液。空隙體積包括任何太大而無法進入介質的顆粒，而溶劑體積被稱為柱體積。
在正相色譜法中，固定相是極性的，流動相是非極性的。極性最小的化合物首先洗脫出來，極性最大的化合物最後洗脫出來。流動相由非極性溶劑（如己烷或庚烷）與稍微極性更大的溶劑（如異丙醇、乙酸乙酯或氯仿）混合組成。隨著流動相中非極性溶劑量的增加，保留率會增加。
反相色譜法（也稱為 RPC 或疏水色譜法）包括任何使用疏水固定相的色譜方法。
“反相”一詞具有歷史背景。在 20 世紀 70 年代，大多數液相色譜使用含有未改性二氧化矽或氧化鋁樹脂的固定相進行。這種方法現在被稱為“正相色譜”。在正相色譜中，固定相是親水的，因此對流動相中的親水分子具有很強的親和力。引入一種使用共價鍵合到固體載體的烷基鏈的技術，創造了一種疏水性固定相，該固定相對疏水化合物具有更強的親和力。使用疏水性固定相可以被認為是正相色譜的相反或“反向”，因此被稱為“反相色譜”。
反相色譜採用極性（水性）流動相。因此，極性流動相中的疏水分子傾向於吸附到疏水性固定相上，而流動相中的親水性分子將穿過色譜柱並首先洗脫。疏水分子可以透過使用有機（非極性）溶劑降低流動相的極性來從色譜柱中洗脫，這會減少疏水相互作用。分子疏水性越強，它與固定相的結合越牢固，洗脫該分子所需的有機溶劑濃度就越高。
親和色譜基於分析物與特定分子之間選擇性非共價相互作用。它非常特異，但不很穩健。它通常用於生物化學中，用於純化與標籤結合的蛋白質。這些融合蛋白用組氨酸標籤、生物素或抗原等化合物標記，這些化合物特異性地與固定相結合。
親和色譜通常利用生物分子對金屬（Zn、Cu、Fe 等）的親和力。色譜柱通常是手工製備的。傳統的親和色譜柱用作製備步驟，以沖洗掉不需要的生物分子。
固定化金屬離子親和色譜 (IMAC) 基於氨基酸，特別是組氨酸與金屬的特定配位共價鍵。該技術透過允許具有對金屬離子親和力的蛋白質保留在含有固定化金屬離子的色譜柱中而起作用，例如鈷、鎳、銅用於純化含有組氨酸的蛋白質或肽，鐵、鋅或鎵用於純化磷酸化蛋白質或肽。許多天然存在的蛋白質沒有對金屬離子的親和力，因此可以使用重組 DNA 技術將這種蛋白質標籤引入相關基因中。用於洗脫目標蛋白質的方法包括改變 pH 或新增競爭性分子，如咪唑。
該程式的另一種用途是從血清中親和純化抗體。如果已知血清含有針對特定抗原的抗體（例如，如果血清來自針對相關抗原免疫的生物體），則可以使用它來親和純化該抗原。這也稱為免疫親和色譜。例如，如果生物體針對 GST 融合蛋白進行免疫，它將產生針對融合蛋白的抗體，以及可能針對 GST 標籤的抗體。然後，該蛋白可以共價偶聯到瓊脂糖等固體載體上，並在抗體從免疫血清中純化時用作親和配體。
為了全面起見，GST 蛋白和 GST 融合蛋白可以分別單獨偶聯。血清最初被允許與 GST 親和基質結合。這將去除針對融合蛋白的 GST 部分的抗體。然後將血清與固體載體分離，並允許其與 GST 融合蛋白基質結合。這使得任何識別抗原的抗體能夠被捕獲在固體載體上。最常使用低 pH 緩衝液（如甘氨酸 pH 2.8）來洗脫感興趣的抗體。將洗脫液收集到中性 Tris 或磷酸鹽緩衝液中，以中和低 pH 洗脫緩衝液並阻止抗體活性的任何降解。
通常採用簡化的策略來純化針對肽抗原產生的抗體。當肽抗原在合成時產生時，在肽的 N 端或 C 端新增一個末端半胱氨酸殘基。該半胱氨酸殘基包含一個巰基官能團，允許肽輕鬆偶聯到載體蛋白（例如，鑰孔血藍蛋白 (KLH)）。相同的含半胱氨酸肽也透過半胱氨酸殘基固定在瓊脂糖樹脂上，然後用於純化抗體。
大多數單克隆抗體已使用基於免疫球蛋白特異性蛋白 A 或蛋白 G 的親和色譜進行純化，這些蛋白 A 或蛋白 G 來自細菌。
親和色譜最常見的用途可能是純化重組蛋白。具有已知親和力的蛋白質被蛋白質標記，以幫助其純化。該蛋白可能已被基因改造，使其能夠被選擇用於親和結合；這被稱為融合蛋白。標籤包括谷胱甘肽-S-轉移酶 (GST)、六組氨酸 (His) 和麥芽糖結合蛋白 (MBP)。組氨酸標籤對鎳或鈷離子具有親和力，這些離子透過與固定相中加入的螯合劑形成配位共價鍵而固定化。為了洗脫，使用過量的能夠作為金屬離子配體的化合物，例如咪唑。GST 對谷胱甘肽具有親和力，谷胱甘肽可作為谷胱甘肽瓊脂糖商購獲得。在洗脫過程中，使用過量的谷胱甘肽來取代標記的蛋白質。
高效液相色譜 (HPLC) 依靠泵將加壓的液體溶劑（含有樣品混合物）透過裝有固體吸附劑的色譜柱。HPLC 與傳統的（“低壓”）液相色譜的區別在於，操作壓力要高得多（50-350 巴），而普通液相色譜通常依靠重力將流動相透過色譜柱。由於在分析型 HPLC 中分離的樣品量很小，典型的色譜柱尺寸為 2.1-4.6 毫米直徑，30-250 毫米長度。此外，HPLC 色譜柱採用更小的吸附劑顆粒（平均粒徑為 2-50 微米）。這使得 HPLC 在分離混合物時具有更高的分離能力，這就是它成為一種流行的色譜技術的原因。
HPLC 儀器的示意圖通常包括一個進樣器、泵和一個檢測器。進樣器將樣品混合物帶入流動相流中，流動相流將其帶入色譜柱。泵以所需流速和流動相組成將流動相透過色譜柱。檢測器產生與從色譜柱中出來的樣品組分量成比例的訊號，因此允許對樣品組分進行定量分析。數字微處理器和使用者軟體控制 HPLC 儀器並提供資料分析。HPLC 儀器中一些機械泵型號可以將多種溶劑混合在一起，比例隨時間變化，在流動相中產生組成梯度。各種檢測器在使用中很常見，例如 UV/Vis、光電二極體陣列 (PDA) 或基於質譜法。大多數 HPLC 儀器還具有一個色譜柱恆溫箱，允許調整分離執行的溫度。