生命科學方法與概念/蛋白質電泳
SDS-PAGE 是一種常用的聚丙烯醯胺凝膠電泳 (PAGE)，用於根據蛋白質的分子量分離蛋白質。十二烷基硫酸鈉 (SDS) 是一種陰離子去汙劑，可以使蛋白質的二級和非二硫鍵連線的三級結構變性，並且根據蛋白質的質量為每個蛋白質施加負電荷。除了 SDS 外，蛋白質也可以選擇地在還原劑（如二硫蘇糖醇 (DTT) 或 2-巰基乙醇 (β-巰基乙醇/BME)）存在下短暫加熱至接近沸騰，從而透過減少二硫鍵進一步使蛋白質變性，從而克服某些形式的三級蛋白質摺疊並破壞四級蛋白質結構（寡聚亞基）。這被稱為還原性 SDS-PAGE。
凝膠通常由丙烯醯胺、雙丙烯醯胺、變性劑 (SDS) 和調整過 pH 值的緩衝液組成。該溶液可以在真空下脫氣，以防止在聚合過程中形成氣泡。或者，可以在凝膠灌注後將丁醇新增到分離凝膠中（用於蛋白質），因為丁醇可以去除氣泡並使表面光滑。為了啟動聚合，添加了自由基來源和穩定劑，例如過硫酸銨和 TEMED。聚合反應由於新增的雙丙烯醯胺而產生了凝膠，雙丙烯醯胺可以在兩個聚丙烯醯胺分子之間形成交聯。雙丙烯醯胺與丙烯醯胺的比例可以根據特殊目的進行調整，但通常約為 1:35。凝膠的丙烯醯胺濃度也可以改變，通常在 5% 到 25% 的範圍內。較低百分比的凝膠更適合分離非常高分子量的分子，而較高百分比的凝膠則需要分離較小的蛋白質。
凝膠通常在凝膠鑄造器中的兩塊玻璃板之間聚合，在頂部插入一個梳子以建立樣品孔。在凝膠聚合後，可以取出梳子，凝膠就準備好進行電泳了。
PAGE 中使用各種緩衝液體系，具體取決於樣品的性質和實驗目標。在陽極和陰極使用的緩衝液可以相同也可以不同。
在凝膠上施加電場，導致帶負電荷的蛋白質或核酸從負極（陰極）遷移到正極（陽極）穿過凝膠。根據其大小，每種生物分子在凝膠基質中移動的方式不同：小分子更容易穿過凝膠中的孔，而大分子則更加困難。凝膠通常執行幾個小時，儘管這取決於施加在凝膠上的電壓；在較高電壓下遷移速度更快，但這些結果通常不如較低電壓下準確。在設定的時間後，生物分子根據其大小遷移了不同的距離。較小的生物分子在凝膠中遷移得更遠，而較大的生物分子則停留在接近起點的位置。因此，生物分子可以大致按大小分離，在變性條件下，大小主要取決於分子量，但在天然條件下也取決於更高階的構象。但是，某些糖蛋白在 SDS 凝膠上的行為異常。
類似於核酸凝膠電泳，跟蹤染料也經常使用。通常將已知電泳遷移率的陰離子染料包含在樣品緩衝液中。非常常見的跟蹤染料是溴酚藍。這種染料在鹼性和中性 pH 值下呈色，是一個小的帶負電荷的分子，向陽極移動。它是一種高遷移率分子，因此它比大多數蛋白質更早移動。
大多數蛋白質分離使用“不連續”（或 DISC）緩衝液體系進行，該體系顯著提高了凝膠內條帶的清晰度。在不連續凝膠系統中進行電泳期間，在電泳的早期階段形成離子梯度，導致所有蛋白質集中到一個鋒利的條帶中。離子梯度的形成是透過選擇一個 pH 值來實現的，在該 pH 值下，緩衝液的離子與 SDS 包覆的蛋白質相比，電荷僅中等程度。這些條件提供了一個環境，其中科爾勞施定律決定了摩爾電導率。結果，SDS 包覆的蛋白質在幾分鐘內被濃縮到 19 μm 左右的薄區域內。在這個階段，所有蛋白質透過等速電泳以相同的遷移速度遷移。這發生在凝膠中孔徑較大的區域，因此凝膠基質在聚焦或“堆積”事件期間不會阻礙遷移。蛋白質按大小的分離是在凝膠的較低“分離”區域實現的。分離凝膠通常具有更小的孔徑，這會導致篩分效應，現在決定了蛋白質的電泳遷移率。同時，凝膠的分離部分也具有一個 pH 值，其中緩衝液離子平均帶更大的電荷，導致它們“超過”SDS 覆蓋的蛋白質並消除離子梯度，從而消除堆積效應。
一種非常廣泛的不連續緩衝液體系是 tris-甘氨酸或“Laemmli”體系，它在 pH 6.8 時堆積，在 pH 約為 8.3-9.0 時分離。該體系的缺點是這些 pH 值可能會促進蛋白質中半胱氨酸殘基之間的二硫鍵形成，因為半胱氨酸的 pKa 範圍為 8-9，並且因為載入緩衝液中存在的還原劑不會與蛋白質一起遷移。緩衝技術最近的進展透過在低於半胱氨酸 pKa 的 pH 值（例如雙-tris，pH 6.5）下分離蛋白質來解決這個問題，幷包括還原劑（例如亞硫酸氫鈉），這些還原劑在蛋白質之前移動到凝膠中以保持還原環境。使用較低 pH 值的緩衝液的另一個好處是丙烯醯胺凝膠在較低 pH 值下更穩定，因此凝膠可以在使用前長期儲存。
當施加電壓時，陰離子（和帶負電荷的樣品分子）向下方腔室的正極（陽極）遷移，主導離子是 Cl−（高遷移率和高濃度）；甘氨酸是尾隨離子（低遷移率和低濃度）。SDS-蛋白質顆粒在凝膠緩衝液的 Cl− 和陰極緩衝液的 Gly− 之間的邊界處不會自由遷移。弗里德里希·科爾勞施發現歐姆定律也適用於溶解的電解質。由於 Cl− 和甘氨酸緩衝液之間的電壓降，蛋白質被壓縮（堆積）成微米級的薄層。邊界穿過孔隙梯度，蛋白質堆積由於凝膠基質的摩擦阻力增加而逐漸分散。堆積和解堆積在梯度凝膠中不斷發生，對於每個蛋白質，在不同的位置發生。為了使蛋白質完全解堆積，聚丙烯醯胺凝膠濃度必須超過 16% T。“Laemmli” 的雙凝膠系統是一種簡單的梯度凝膠。緩衝液的 pH 不連續性對分離質量沒有顯著意義，不需要具有不同 pH 的“堆積凝膠”。
考馬斯亮藍 (CBB) 是最流行的蛋白質染料。它是一種陰離子染料，可以非特異性地與蛋白質結合。CBB 的結構主要是非極性的，通常在用乙酸酸化過的甲醇溶液中使用。凝膠中的蛋白質透過乙酸固定，並同時染色。可以透過用相同的不含染料的溶液脫色來去除凝膠中過量的染料。蛋白質以藍色條帶顯示在透明的背景上。由於 SDS 也是陰離子，它可能會干擾染色過程。因此，建議使用大量染色溶液，至少是凝膠體積的十倍。
考馬斯亮藍 G-250 與考馬斯亮藍 R-250 的區別在於添加了兩個甲基。考馬斯亮藍 R-250 名稱中的字尾“R”是紅色的縮寫，因為染料的藍色略帶紅色。對於“G”變體，藍色則帶更多的綠色。最初，“250”表示染料的純度。
銀染是一種比傳統的考馬斯亮藍染色更靈敏的蛋白檢測方法。考馬斯亮藍染色通常可以檢測到50 ng的蛋白條帶，而銀染可以將靈敏度提高50倍。銀染的具體化學機制至今仍未完全清楚。銀染技術由Kerenyi和Gallyas提出，是一種可以檢測凝膠中痕量蛋白質的靈敏方法。該技術已擴充套件到對其他生物大分子進行研究，這些生物大分子已在各種支援物中分離。許多變數會影響顏色強度，每種蛋白質都有其獨特的染色特性。乾淨的玻璃器皿、純試劑和高純度水是成功染色的關鍵。銀染技術起源於14世紀，用於對玻璃表面進行染色。自16世紀以來，該技術被廣泛用於此目的。早期的銀染產生的顏色介於淺黃色和橙紅色之間。卡米洛·高爾基完善了銀染技術，用於研究神經系統。高爾基的方法隨機地完整地染色了少量細胞。
等電聚焦 (IEF)，也稱為電聚焦，是一種根據分子等電點 (pI) 的差異分離不同分子的技術。它是一種區域電泳形式，通常在凝膠上進行蛋白質分離，利用了目標分子總電荷與其周圍環境 pH 值相關的特點。
IEF 包括將兩性電解質溶液新增到固定化 pH 梯度 (IPG) 凝膠中。IPG 是丙烯醯胺凝膠基質，與 pH 梯度共聚，形成完全穩定的梯度，除了最鹼性 (>12) 的 pH 值。固定化 pH 梯度是透過Immobiline比例的連續變化獲得的。Immobiline 是一種弱酸或鹼，由其 pK 值定義。
在低於其等電點 (pI) 的 pH 區域中，蛋白質將帶正電荷，因此將遷移至陰極（帶負電荷的電極）。然而，當它遷移至 pH 梯度逐漸升高的區域時，蛋白質的總電荷將減小，直到蛋白質達到與其 pI 相對應的 pH 區域。此時，它不帶淨電荷，因此遷移停止（因為沒有對任何電極的電吸引力）。結果，蛋白質被聚焦成尖銳的固定條帶，每個蛋白質都位於與自身 pI 相對應的 pH 梯度點上。該技術能夠實現極高的解析度，即使蛋白質只差一個電荷也可以被分離成不同的條帶。
要聚焦的分子分佈在具有 pH 梯度（通常由脂肪族兩性電解質建立）的介質中。電流透過介質，建立“正”陽極和“負”陰極端。帶負電荷的分子透過介質中的 pH 梯度遷移至“正”端，而帶正電荷的分子遷移至“負”端。當粒子朝著與其電荷相反的極移動時，它會透過不斷變化的 pH 梯度，直到到達該分子等電點的 pH 值。此時，分子不再帶淨電荷（由於與相關官能團的質子化或去質子化），因此不會在凝膠中繼續移動。透過首先將具有不同 pI 值的小分子（如多聚兩性電解質）的溶液進行電泳來建立梯度。
該方法在蛋白質研究中應用尤其廣泛，蛋白質根據其酸性和鹼性殘基的相對含量進行分離，其值由 pI 表示。蛋白質被引入到由聚丙烯醯胺、澱粉或瓊脂糖組成的固定化 pH 梯度凝膠中，其中已建立了 pH 梯度。在該過程中通常使用具有較大孔徑的凝膠，以消除任何“篩分”效應，或由蛋白質尺寸不同導致的遷移速率差異而引起的 pI 偽影。等電聚焦可以分辨 pI 值相差 0.01 的蛋白質。
二維凝膠電泳，縮寫為 2-DE 或 2-D 電泳，是一種凝膠電泳形式，通常用於透過二維分離蛋白質混合物，根據兩個特性進行分離。
2-D 電泳從 1-D 電泳開始，但隨後以與第一方向 90 度角的第二特性分離分子。在 1-D 電泳中，蛋白質（或其他分子）在一個維度上分離，因此所有蛋白質/分子將位於一條泳道上，但這些分子會在 2-D 凝膠中散開。由於兩個分子不太可能在兩個不同的特性上相似，因此在 2-D 電泳中，分子的分離效果比 1-D 電泳更有效。
2-D 電泳通常從等電聚焦開始。之後，蛋白質用十二烷基硫酸鈉 (SDS) 處理，並根據其質量與第一個電場成 90° 角進行分離。
天然凝膠在非變性條件下執行，因此分析物的天然結構得以保持。這使得摺疊或組裝的複合物的物理尺寸影響遷移率，從而可以分析生物分子結構的所有四個級別。對於生物樣本，僅在必要的情況下使用去垢劑來裂解細胞中的脂質膜。複合物在很大程度上保持關聯和摺疊，就像它們在細胞中一樣。然而，一個缺點是複合物可能無法乾淨或可預測地分離，因為難以預測分子的形狀和尺寸對其遷移率的影響。
與變性方法不同，天然凝膠電泳不使用帶電的變性劑。因此，分離的分子（通常是蛋白質或核酸）不僅在分子量和固有電荷方面不同，而且在橫截面積方面也不同，因此會根據整體結構的形狀體驗不同的電泳力。對於蛋白質，由於它們保持在天然狀態，因此它們不僅可以透過一般的蛋白質染色試劑進行視覺化，還可以透過特定的酶聯染色進行視覺化。
BN-PAGE 是一種天然 PAGE 技術，其中考馬斯亮藍染料為蛋白質複合物提供必要的電荷，以進行電泳分離。考馬斯亮藍的缺點是，它在與蛋白質結合時可以像去垢劑一樣起作用，導致複合物解離。另一個缺點是可能抑制化學發光（例如，在隨後的蛋白質印跡檢測或活性測定中）或具有輔助基團（例如血紅素或葉綠素）或用熒光染料標記的蛋白質的熒光。
CN-PAGE（通常稱為天然 PAGE）在聚丙烯醯胺梯度凝膠中分離酸性水溶性和膜蛋白。它不使用帶電染料，因此 CN-PAGE 中蛋白質的電泳遷移率（與電荷轉移技術 BN-PAGE 相比）與蛋白質的固有電荷有關。遷移距離取決於蛋白質電荷、其大小和凝膠的孔徑。在許多情況下，該方法的解析度低於 BN-PAGE，但 CN-PAGE 在考馬斯亮藍染料會干擾進一步分析技術的情況下具有優勢，例如，它已被描述為一種非常有效的微型分離技術，用於 FRET 分析。CN-PAGE 也比 BN-PAGE 更溫和，因此它可以保留在 BN-PAGE 條件下解離的膜蛋白複合物的易變超分子組裝體。