生命科學方法與概念/用於 DNA 操作的酶
限制性內切酶（或限制性核酸內切酶）是一種酶，它在稱為限制性位點的特定識別核苷酸序列處或附近切割 DNA。 為了切割 DNA，所有限制性內切酶都會在 DNA 雙螺旋的每個糖磷酸骨架上進行兩次切割。
這些酶存在於細菌和古細菌中，並提供了一種防禦入侵病毒的機制。 在原核生物內部，限制性內切酶選擇性地切割稱為限制的外源 DNA； 而宿主 DNA 受修飾酶（一種甲基化酶）的保護，該酶修飾原核生物 DNA 並阻止切割。 這些過程共同構成了限制修飾系統。
已有超過 3000 種限制性內切酶得到詳細研究，其中超過 600 種可商購。 這些酶通常用於實驗室中的 DNA 修飾，是分子克隆中必不可少的工具。
限制性內切酶通常分為四種類型，它們在結構上有所不同，並且在它們是否在其識別位點切割其 DNA 底物或識別位點和切割位點是否彼此分離方面有所不同。
- I 型酶在遠離識別位點的位點切割，並且需要 ATP 和 S-腺苷-L-蛋氨酸 (SAM) 才能發揮作用。 它們是具有限制和甲基化活性的多功能蛋白。
- II 型酶在其識別位點或識別位點附近很短的特定距離處切割； 大多數需要鎂。 它們是獨立於甲基化酶的單功能（限制）酶。
- III 型酶在其識別位點附近很短的距離處切割。 它們需要 ATP（但不會水解它）； S-腺苷-L-蛋氨酸刺激反應，但不是必需的。 它們作為與修飾甲基化酶的複合體的一部分存在。
- IV 型酶靶向修飾的 DNA，例如甲基化、羥甲基化和葡糖基-羥甲基化 DNA。
II 型限制性內切酶在分子生物學中最為常見，因為它們具有明確定義的切割位點，並且不需要 ATP。 它們的識別位點通常是迴文序列，長度為 4-8 個核苷酸。 從影像中可以看出，它們是同型二聚體。
限制性內切酶以它們被分離出來的細菌命名。 第一個字母代表細菌屬，第二、第三個字母代表種，可以新增第四個字母來識別菌株。 來自同一細菌的酶可以透過表示隔離順序的拉丁數字來區分。
具有相同識別序列並以相同方式切割它的限制性內切酶被稱為等切酶。 異切酶是識別相同序列但以不同方式切割它的酶。
下表概述了質粒 DNA 分析和製備酶切的典型方案。
| 分析酶切 | 製備酶切 | |
| 質粒 DNA | 0.1 – 0.5 µg | 1 – 5 µg |
| 限制性內切酶 A | 0.5 µl | 1 – 2 µl |
| 限制性內切酶 B | 0.5 µl | 1 – 2 µl |
| 10x 緩衝液 | 總體積的 10% | 總體積的 10% |
| 水 | 補充至總體積 | 補充至總體積 |
| 總體積 | 10 µl | 25 – 50 µl |
| 孵育溫度 | 37 °C | 37 °C |
| 孵育時間 | 10 分鐘 – 2 小時 | 10 分鐘 – 過夜 |
如果目的是為分子克隆建立載體，則質粒必須完全酶切，否則沒有插入片段的質粒可能會被轉化並導致假陽性菌落。 插入片段的酶切不太關鍵，因此可以更短。
一些供應商提供最佳化的限制性內切酶，它們都在相同的緩衝液中具有活性，並且只需要非常短的孵育時間。 對於使用經典酶進行雙酶切，有必要檢查它們的相容性。
酶體積不應超過總體積的 10%，以防止由於甘油過量（限制性內切酶以 50% 甘油形式提供）導致抑制或星號活性。 限制性內切酶通常儲存在 -20 °C，在不放入冰箱時應放在冰上。 它們應該是最後新增到反應中的成分。 不建議渦旋混合。
一些限制性內切酶如果 DNA 被甲基化，則無法識別它們的限制性位點。 在使用表達甲基化酶的大腸桿菌菌株時，應考慮這一點。
乙醇、EDTA、苯酚、氯仿或去汙劑等汙染物會干擾酶的活性，因此 DNA 應不含這些汙染物。
- REBASE 是最全面的限制性內切酶資料庫
- NEBcutter 在 DNA 序列中查詢限制性位點
- 商業供應商的網站 NEB 和 Thermo Scientific 包含有關限制性內切酶的廣泛資訊
DNA 連線酶是一種酶，它透過催化磷酸二酯鍵的形成來促進 DNA 鏈的連線。 它在活生物體中修復雙鏈 DNA 中的單鏈斷裂中發揮作用，但一些形式（如 DNA 連線酶 IV）可能專門修復雙鏈斷裂（即 DNA 的兩個互補鏈中的斷裂）。 單鏈斷裂透過 DNA 連線酶使用雙螺旋的互補鏈作為模板進行修復，DNA 連線酶建立最終的磷酸二酯鍵以完全修復 DNA。
DNA 連線酶在 DNA 修復和 DNA 複製中都有應用。 此外，DNA 連線酶在分子生物學實驗室中廣泛用於重組 DNA 實驗。
DNA 連線酶的機制是形成兩個共價磷酸二酯鍵，一個核苷酸（“受體”）的 3' 羥基末端與另一個核苷酸（“供體”）的 5' 磷酸末端連線。 ATP 是連線酶反應所必需的，該反應分三個步驟進行
- 酶活性中心的賴氨酸殘基的腺苷酸化（新增 AMP），釋放焦磷酸；
- 將 AMP 轉移到所謂供體的 5' 磷酸上，形成焦磷酸鍵；
- 供體 5' 磷酸與受體 3' 羥基之間形成磷酸二酯鍵。
雖然連線酶也能處理平末端，但這需要更高的酶濃度和不同的反應條件。
大腸桿菌 DNA 連線酶由lig基因編碼。大腸桿菌以及大多數原核生物中的 DNA 連線酶利用裂解煙醯胺腺嘌呤二核苷酸 (NAD) 獲得的能量來形成磷酸二酯鍵。它不會連線平末端的 DNA，除非在聚乙二醇的分子擁擠條件下，並且不能有效地將 RNA 連線到 DNA。
來自噬菌體 T4 的 DNA 連線酶是實驗室研究中最常用的連線酶。它可以連線 DNA 的粘性末端或“粘性”末端、寡核苷酸以及 RNA 和 RNA-DNA 雜交體，但不能連線單鏈核酸。它還可以以比大腸桿菌 DNA 連線酶高得多的效率連線平末端的 DNA。與大腸桿菌 DNA 連線酶不同，T4 DNA 連線酶不能利用 NAD，並且它對 ATP 作為輔因子有絕對的需要。一些工程學已經完成，以改善 T4 DNA 連線酶的體內活性；例如，一種成功的方法測試了與幾種替代 DNA 結合蛋白融合的 T4 DNA 連線酶，發現具有 p50 或 NF-kB 作為融合伴侶的構建體在用於克隆目的的平末端連線中的活性比野生型 T4 DNA 連線酶高出 160% 以上。
磷酸酶是一種酶，透過水解磷酸單酯將磷酸基團從其底物上移除，生成磷酸根離子並帶有一個遊離羥基的分子（去磷酸化）。這種作用與磷酸化酶和激酶的作用完全相反，磷酸化酶和激酶利用像 ATP 這樣的高能分子將其底物連線到磷酸基團。許多生物體中常見的磷酸酶是鹼性磷酸酶。另一大類存在於古細菌、細菌和真核生物中的蛋白質表現出脫氧核苷酸和核苷酸磷酸酶或焦磷酸酶活性，這些活性催化 dNTP/NTP 分解成 dNDP/NDP 和一個遊離磷酸根離子或 dNMP/NMP 和一個遊離焦磷酸根離子。
半胱氨酸依賴性磷酸酶 (CDP) 透過磷酸半胱氨酸中間體催化磷酸酯鍵的水解。
遊離半胱氨酸親核試劑與磷酸部分的磷原子形成鍵，連線磷酸基團與酪氨酸的 P-O 鍵被質子化，要麼透過一個適當位置的酸性氨基酸殘基（下圖中的 Asp）或一個水分子。然後磷酸半胱氨酸中間體被另一個水分子水解，從而為另一個去磷酸化反應再生活性位點。
金屬磷酸酶（例如 PP2C）在其活性位點內協調兩個催化必需的金屬離子。目前，這些金屬離子的身份存在一些混亂，因為連續嘗試識別它們產生了不同的答案。目前有證據表明這些金屬可能是鎂、錳、鐵、鋅或它們的任何組合。人們認為一個連線兩個金屬離子的羥基離子參與了對磷離子的親核攻擊。
鹼性磷酸酶 (EC 3.1.3.1) 可以去除許多型別分子的磷酸基團，包括核苷酸、蛋白質和生物鹼。顧名思義，鹼性磷酸酶在鹼性環境中最有效。
實驗室中鹼性磷酸酶的典型用途包括去除磷酸單酯以防止自連線。
研究中常用的鹼性磷酸酶包括
- 蝦鹼性磷酸酶 (SAP)，來自一種北極蝦 (Pandalus borealis)。這種磷酸酶很容易被熱量滅活，這在某些應用中是一個有用的特性。
- 小牛腸鹼性磷酸酶 (CIP)
- 胎盤鹼性磷酸酶 (PLAP) 及其 C 端截短版本，缺少最後 24 個氨基酸（構成針對 GPI 膜錨定的結構域） - 分泌型鹼性磷酸酶 (SEAP)
鹼性磷酸酶已成為分子生物學實驗室的有用工具，因為 DNA 通常在其 5' 端具有磷酸基團。去除這些磷酸基團可以防止 DNA 連線（5' 端連線到 3' 端），從而使 DNA 分子保持線性，直到準備它們用於下一步驟；此外，去除磷酸基團允許放射性標記（用放射性磷酸基團替換），以便透過過程或實驗的後續步驟來測量標記 DNA 的存在。出於這些目的，來自蝦的鹼性磷酸酶是最有用的，因為它在完成工作後最容易滅活。
鹼性磷酸酶的另一個重要用途是作為酶聯免疫測定的標記。
未分化的多能幹細胞在其細胞膜上具有較高水平的鹼性磷酸酶，因此鹼性磷酸酶染色用於檢測這些細胞並測試多能性（即，胚胎幹細胞或胚胎癌細胞）。
外切核酸酶 III (ExoIII) 催化雙鏈 DNA 3´-羥基末端單核苷酸的逐步去除。在每個結合事件期間去除的核苷酸數量有限，導致 DNA 分子群體中協調的漸進性缺失。優選的底物是平端或凹陷的 3´-末端，雖然 ExoIII 也作用於雙鏈 DNA 中的切口以產生單鏈缺口。該酶在單鏈 DNA 上沒有活性，因此 3´-突出末端對切割有抵抗力。抵抗程度取決於延伸的長度，4 個鹼基或更長的延伸基本上對切割有抵抗力。該特性用於從具有一個耐受性（3´-懸垂）和一個敏感性（平端或 5´-懸垂）末端的線性分子中產生單向缺失。
核酸酶 S1 是一種源自米麴黴的內切核酸酶，它將單鏈 DNA 和 RNA 分解成寡核苷酸或單核苷酸。核酸酶 S1 用於從 DNA 分子中去除單鏈尾部以建立平末端，用於開啟在合成雙鏈 cDNA 過程中生成的頭髮夾環，並作為核酸酶保護測定中的試劑。
Taq 聚合酶是一種耐熱 DNA 聚合酶，它於 1965 年從嗜熱細菌溫泉熱菌中分離出來。
溫泉熱菌是一種生活在溫泉和熱液噴口中的細菌，Taq 聚合酶被鑑定為一種能夠耐受 PCR 過程中所需的蛋白質變性條件（高溫）的酶。因此，它取代了最初用於 PCR 的大腸桿菌DNA 聚合酶。Taq 的最佳活性溫度為 75–80 °C，在 92.5 °C 下的半衰期大於 2 小時，在 95 °C 下的半衰期為 40 分鐘，在 97.5 °C 下的半衰期為 9 分鐘，並且可以在 72 °C 下在不到 10 秒的時間內複製 1000 個鹼基對的 DNA 鏈。
Taq 聚合酶缺乏 3' 到 5' 外切核酸酶校對活性，導致複製保真度相對較低。最初，它的錯誤率被測量為大約 1/9,000 個核苷酸。Taq 具有末端轉移酶活性，這意味著它在 3' 端新增腺嘌呤懸垂。
Pfu DNA 聚合酶是從超嗜熱古細菌Pyrococcus furiosus中分離出來的。與Taq DNA 聚合酶相比，它具有更高的熱穩定性和校對能力。與Taq DNA 聚合酶不同，Pfu DNA 聚合酶具有 3' 到 5' 核酸外切酶校對活性，這意味著它沿著 DNA 從 5' 端到 3' 端進行工作，並糾正核苷酸摻入錯誤。這意味著Pfu DNA 聚合酶生成的 PCR 片段將比Taq 生成的 PCR 插入片段具有更少的錯誤。然而，Pfu 速度較慢，通常需要每迴圈 1-2 分鐘才能在 72 °C 下擴增 1 kb 的 DNA。在 PCR 反應中使用Pfu DNA 聚合酶會導致產生平端 PCR 產物。