生命科學方法與概念/基因工程
基因工程指的是對活生物體的基因組進行靶向、特異性修飾的策略和技術。
早期的基因工程方法只涉及使用同源重組來修飾遺傳序列。使用位於另一條鏈上的同源序列作為模型可以引導這種自然的DNA修復機制來修復DNA鏈。可以使用載體（如修飾後的逆轉錄病毒基因組）將外源DNA鏈插入細胞中，從而誘導細胞DNA鏈與外源DNA鏈之間的同源重組。重組現象具有足夠的靈活性，可以對目標同源區域引入一定程度的改變（新增、抑制或修飾DNA部分）。
在進行進一步的開發以提高體細胞型別中同源重組率之前，僅使用同源重組來修飾基因組仍然是一個漫長且隨機的過程。這些開發包括使用定點內切核酸酶，它們透過引起雙鏈DNA斷裂來實現基因修飾，從而觸發細胞的自然DNA修復機制，主要是非同源末端連線（NHEJ）以及低頻的同源重組（HR）。
分子生物學中常用的限制性內切酶與1至10個核苷酸的序列相互作用。這些序列非常短，通常是迴文序列，在基因組中通常會出現在多個位點（人類基因組包含64億個鹼基）。因此，限制性內切酶很可能在多個位點切割DNA分子。因此，在努力尋找更精確、更安全的基因組手術方法時，科學家們轉向了更精確的工具。
透過使用能夠識別和與足夠長的DNA序列相互作用的酶，可以進行更靶向的基因組工程，這些序列在任何給定的基因組中可能只出現一次，具有很高的機率。因此，DNA修飾精確地發生在靶序列位點。巨核酸酶和鋅指核酸酶的識別位點超過12個鹼基對，提供了這種精確度。
一旦DNA被切割，自然的DNA修復機制和同源重組就可以使修飾後的序列或新基因整合進去。
這些不同階段（識別、切割和重組）的成功取決於各種因素，包括將酶匯入細胞的載體的效率、酶切割活性、細胞的同源重組能力，以及可能在給定基因座處的染色質狀態。
巨核酸酶於20世紀80年代後期被發現，是內切核酸酶家族中的酶，其特點是能夠識別和切割大型DNA序列（從12到40個鹼基對）。最廣泛和最著名的巨核酸酶是LAGLIDADG家族中的蛋白質，它們的名字來源於一個保守的氨基酸序列。
20世紀90年代，這些酶被確定為基因工程的有希望的工具。然而，即使它們存在於自然界中，並且每個酶在其DNA識別位點都表現出輕微的變化，但幾乎沒有機會找到能夠作用於特定DNA序列的精確巨核酸酶。因此，每個新的基因工程目標都需要一個初始的蛋白質工程階段，以產生定製的巨核酸酶。
有兩種方法可以建立定製的巨核酸酶
- 誘變涉及使用具有類似於所需酶的性質的巨核酸酶產生變異體集合，然後使用高通量篩選來選擇這些變異體。該過程可以透過採用所謂的“半理性”方法來最佳化，其中結構資料被電子處理，以便將誘變集中在酶與DNA相互作用並觸發切割的部分。
- 組合裝配是一種方法，透過該方法，來自不同酶的蛋白質亞基可以被關聯或融合。
這兩種方法可以結合使用。已經建立了一個包含數萬個蛋白質單元的大型庫。這些單元可以組合起來，以獲得識別靶位點的嵌合巨核酸酶。這種技術已經使開發了針對病毒、植物等基因組中序列的幾種特異性巨核酸酶成為可能。
鋅指基序出現在幾種轉錄因子中。鋅離子存在於所有人類蛋白質的8%，在它們的三維結構的組織中起著重要作用。在轉錄因子中，它最常位於蛋白質-DNA相互作用位點，在那裡它穩定基序。每個指的C端負責特定識別DNA序列。
識別的序列很短，大約由3個鹼基對組成，但透過結合6到8個識別位點已被表徵的鋅指，可以獲得針對大約20個鹼基對的序列的特異性蛋白質。因此，可以控制特定基因的表達。也可以將以這種方式構建的蛋白質與內切核酸酶的催化結構域融合，以誘導靶向的DNA斷裂，因此可以使用這些蛋白質作為基因工程工具。
通常採用的一種方法涉及將兩種蛋白質（每種蛋白質包含3到6個特定選擇的鋅指）與FokI內切核酸酶的催化結構域關聯。這兩種蛋白質識別彼此相距幾個核苷酸的兩個DNA序列。將兩個鋅指蛋白與其各自的序列連線在一起，使與它們相關的兩個內切核酸酶更加接近。這意味著它們可以二聚化，然後切割DNA分子。
使用了幾種方法來設計針對選定序列的特異性鋅指核酸酶。最廣泛的方法是將具有已知特異性的鋅指單元結合起來（模組化組裝）。已經開發出各種選擇技術，使用細菌、酵母或哺乳動物細胞，來識別提供最佳特異性和最佳細胞耐受性的組合。
轉錄啟用樣效應因子核酸酶（TALENs）是由將特異性DNA結合結構域融合到通用DNA切割結構域而產生的合成限制性內切酶。可以設計為結合任何所需DNA序列的DNA結合結構域來自TAL效應因子，TAL效應因子是由感染植物的某些細菌分泌的DNA結合蛋白。TALENs的使用方式類似於設計的鋅指核酸酶。
CRISPR（成簇的規律間隔的短迴文重複序列）是細菌用作一種獲得性免疫來抵禦病毒的遺傳元件。它們由源自病毒基因組的短序列組成，並已整合到細菌基因組中。Cas（CRISPR相關）蛋白處理這些序列並切割匹配的病毒DNA序列。透過將包含Cas基因和特異性構建的CRISPR的質粒引入真核細胞，基因組可以在任何所需的位置被切割。
CRISPR/Cas9系統自2013年以來徹底改變了基因工程領域。使用CRISPR編輯基因組涉及表達RNA引導的Cas9內切核酸酶，以及引導RNA，將其引導到要編輯的特定靶序列進行切割。當Cas9切割靶序列時，細胞被誘導透過用研究人員提供的改變版本替換原始序列來修復損傷。由於製作引導RNA以引導Cas9切割任何基因非常簡單，因此CRISPR極大地簡化了刪除、新增或修飾基因的過程。截至2014年，它已成功在包括人類細胞在內的20種物種中進行了測試。在這些物種中，許多物種的編輯是在產生精子或卵子的細胞中完成的，使它們能夠被後代遺傳。