免疫測定

蛋白質印跡法

蛋白質印跡法（有時稱為蛋白質免疫印跡）是一種廣泛使用的分析技術，用於檢測樣本中的特定蛋白質。它使用凝膠電泳以三維結構分離天然蛋白質或以多肽長度分離變性蛋白質。然後將蛋白質轉移到膜（通常是硝酸纖維素或PVDF），並在那裡用針對目標蛋白質的特異性抗體進行染色。凝膠電泳步驟包含在蛋白質印跡分析中，以解決抗體交叉反應的問題。許多搜尋引擎（如CiteAb）可以幫助研究人員找到適合用於蛋白質印跡的抗體。

蛋白質印跡法這個名字是對Southern印跡法的戲稱，Southern印跡法是一種更早由Edwin Southern 開發的用於檢測DNA的技術。RNA的檢測被稱為Northern印跡法。

程式

電泳

錯誤：未找到引用錯誤：未找到引用樣本中的蛋白質使用凝膠電泳分離。蛋白質的分離可以是透過等電點（pI）、分子量、電荷或這些因素的組合。SDS-PAGE 是迄今為止最常見的凝膠電泳型別。也可以使用二維凝膠電泳。

轉移

為了使蛋白質能夠被抗體檢測到，它們需要從凝膠中轉移到由硝酸纖維素或聚偏二氟乙烯（PVDF）製成的膜上。轉移蛋白質的主要方法稱為電印跡，它使用電流將蛋白質從凝膠中拉到膜上。一種較舊的轉移方法涉及將膜放在凝膠頂部，然後在膜頂部放置一堆濾紙。將整個疊層放入緩衝溶液中，緩衝溶液透過毛細管作用向上移動紙張，將蛋白質帶到一起。在實踐中，這種方法不再使用，因為它太耗時。由於任何一種印跡過程，蛋白質都會暴露在薄的表面層上，以便進行檢測（見下文）。兩種膜都被選擇用於它們的非特異性蛋白質結合特性（即平等地結合所有蛋白質）。蛋白質結合基於疏水相互作用，以及膜和蛋白質之間的帶電相互作用。硝酸纖維素膜比PVDF膜便宜，但更脆弱，不能很好地耐受重複探測。

可以使用考馬斯亮藍或麗春紅S染料對膜進行染色，檢查蛋白質從凝膠轉移到膜的均勻性和總體有效性。麗春紅S更常見，因為它具有更高的靈敏度和水溶性，後者使其更容易隨後脫色和探測膜，如下所述。

封閉

由於膜被選擇用於其結合蛋白質的能力，因此必須採取措施來防止膜與用於檢測目標蛋白質的抗體之間的相互作用。非特異性結合的封閉是透過將膜放置在稀釋的蛋白質溶液中實現的——通常是3-5%的牛血清白蛋白（BSA）或脫脂奶粉（兩者都不貴）在Tris緩衝鹽水（TBS）或I-Block中，並含有微量的（0.1%）洗滌劑，如吐溫20或Triton X-100。稀釋溶液中的蛋白質會附著在膜上，所有目標蛋白質未附著的地方。因此，當新增抗體時，膜上沒有空間讓它附著，除了在特定目標蛋白質的結合位點。這降低了蛋白質印跡法最終產物中的“噪音”，從而獲得更清晰的結果，並消除了假陽性。

檢測

在檢測過程中，用連線到報告酶的修飾抗體“探測”膜上的目標蛋白。當暴露於合適的底物時，這種酶會驅動顯色反應併產生顏色。由於多種原因，這傳統上是在兩步過程中進行的，儘管現在有一些一步檢測方法可用於某些應用。

在兩步過程中，將稀釋的一抗溶液（通常在0.5到5微克/毫升之間）在輕微攪拌下與膜一起孵育。通常，溶液由緩衝鹽溶液組成，其中包含少量的洗滌劑，有時還包含奶粉或BSA。抗體溶液和膜可以密封在一起孵育，從30分鐘到過夜不等。它也可以在不同的溫度下孵育，更高的溫度與更多的結合相關，既有特異性結合（到目標蛋白質，即“訊號”），也有非特異性結合（“噪音”）。

在沖洗膜以去除未結合的一抗後，將膜暴露於另一種抗體中，該抗體針對一抗的物種特異性部分。抗體來自動物來源（或動物來源的雜交瘤培養物）。抗小鼠二抗幾乎可以結合任何小鼠來源的一抗，這使得整個實驗室能夠共享單一來源的大量生產的抗體，從而節省了一些成本，並提供了更加一致的結果。二抗通常與生物素或報告酶（如鹼性磷酸酶或辣根過氧化物酶）相連。這意味著多個二抗會結合到一個一抗上，從而增強訊號。

最常見的是使用辣根過氧化物酶連線的二抗來裂解化學發光劑，反應產物產生的化學發光強度與蛋白質的量成正比。將一張靈敏的照相膠片放在膜上，暴露於反應產生的光會生成與與印跡結合的抗體相對應的影像。一種更便宜但靈敏度較低的方法是使用1%過氧化氫的4-氯萘酚染色；過氧化物自由基與4-氯萘酚的反應產生深紫色染色，可以在不使用專用照相膠片的情況下進行拍照。

另一種二抗檢測方法利用近紅外（NIR）熒光團連線的抗體。從熒光染料激發產生的光是靜態的，這使得熒光檢測成為對標記抗體與蛋白質印跡中蛋白質結合產生的訊號差異的更精確和準確的測量。蛋白質可以被準確地定量，因為從膜上的不同量蛋白質產生的訊號是在靜態狀態下測量的，而化學發光是在動態狀態下測量光的。

第三種替代方法是使用放射性標記而不是連線到二抗的酶，例如用放射性碘同位素標記抗體結合蛋白（如金黃色葡萄球菌蛋白A或鏈黴親和素）。由於其他方法更安全、更快、更便宜，因此這種方法現在很少使用；然而，這種方法的一個優點是基於自顯影的成像的靈敏度，當與光學軟體（例如Optiquant）結合使用時，它能夠進行非常精確的蛋白質定量。

由於在不同的過程中生產初級和二級抗體比較容易，因此探測過程在歷史上分兩步進行。這在靈活性方面為研究人員和公司帶來了巨大的優勢，並在檢測過程中增加了放大步驟。然而，隨著高通量蛋白質分析和更低檢測限的出現，人們對開發一步探測系統產生了興趣，這種系統可以使該過程更快、消耗更少的試劑。這需要一種探測抗體，既能識別目標蛋白質，又能包含可檢測的標記，這些探測抗體通常可用於已知的蛋白質標籤。將初級探測抗體與膜一起孵育，其方式類似於兩步法中的初級抗體，然後在經過一系列洗滌步驟後即可進行直接檢測。

分析

在洗去未結合的探測抗體後，Western Blot 就可以檢測到標記並與目標蛋白質結合的探測抗體。在實踐中，並非所有的 Western Blot 都會在膜上只顯示一個條帶的蛋白質。透過將染色條帶與電泳過程中載入的標記或階梯進行比較，可以得到大小的近似值。該過程通常會針對結構蛋白重複進行，例如肌動蛋白或微管蛋白，這些蛋白在樣本之間不應該發生變化。透過將目標蛋白質的量標準化為結構蛋白，可以對組間進行控制。更優的策略是將總蛋白質標準化為用三氯乙醇或赤黴素處理後的總蛋白質。這種做法確保在出現錯誤或轉印不完全的情況下，對膜上的總蛋白質含量進行校正。

比色法檢測方法依賴於將 Western Blot 與底物一起孵育，該底物會與結合到二級抗體上的報告酶（例如過氧化物酶）反應。這會將可溶性染料轉化為不同顏色的不溶性形式，該形式會沉澱在酶旁邊，從而使膜染色。然後透過洗去可溶性染料來停止印跡的顯影。透過密度測定（染色的強度）或分光光度法來評估蛋白質水平。

化學發光檢測方法依賴於將 Western Blot 與底物一起孵育，該底物在暴露於二級抗體上的報告物時會發光。然後，CCD 相機檢測到光，捕捉到 Western Blot 的數字影像或膠片影像。膠片在 Western Blot 檢測中的使用正在慢慢消失，因為影像的非線性（非準確量化）。透過密度測定法分析影像，該方法評估蛋白質染色的相對量，並將結果量化為光密度。如果使用合適的標準，更新的軟體可以進行進一步的資料分析，例如分子量分析。

放射性標記不需要酶底物，而是允許將醫用 X 射線膠片直接放置在 Western Blot 上，該膠片會在暴露於標記時顯影，併產生與感興趣的蛋白質條帶相對應的暗區。放射性檢測方法的重要性正在下降，因為它存在危險的輻射，成本很高，健康和安全風險很高，而 ECL（增強化學發光）提供了一個有用的替代方案。

熒游標記探針被光激發，然後透過光電感測器（例如配備有適當發射濾光片的 CCD 相機）檢測激發的發射，該相機捕捉到 Western Blot 的數字影像，並允許進行進一步的資料分析，例如分子量分析和定量 Western Blot 分析。熒光被認為是定量最好的方法之一，但靈敏度低於化學發光。

ELISA

酶聯免疫吸附試驗（ELISA）是一種使用抗體和顏色變化來檢測物質的試驗。ELISA 已被用作醫學和植物病理學中的診斷工具，以及各種行業中的質量控制檢查。

進行 ELISA 至少需要一種針對感興趣物質的特異性抗體。具有未知數量這種抗原的樣本被固定在固體載體上（通常是聚苯乙烯微孔板），無論是非特異性地（透過吸附到表面）還是特異性地（透過另一種針對相同抗原的抗體捕獲，在“夾心”ELISA 中）。在抗原固定後，新增檢測抗體，與抗原形成複合物。檢測抗體可以共價連線到酶上，也可以被連線到酶的二級抗體檢測。在每一步之間，通常用溫和的去汙劑溶液洗滌板，以去除任何非特異性結合的蛋白質或抗體。在最後一步洗滌後，透過新增酶底物顯影板，以產生可見訊號，表明樣本中抗原的量。

使用二級抗體避免了為每種想要檢測的抗原建立酶連線抗體的昂貴過程。透過使用與其他抗體的 Fc 區結合的酶連線抗體，這種相同的酶連線抗體可以在各種情況下使用。ELISA 中使用的酶包括辣根過氧化物酶 (HRP)、鹼性磷酸酶 (AP) 或葡萄糖氧化酶。這些酶允許檢測，因為它們在某些試劑存在下會產生可觀察到的顏色變化。在某些情況下，這些酶會暴露在試劑中，使它們產生光或化學發光。使用酶是因為它們充當放大器，即使只有少量酶連線抗體仍然結合，也能產生可檢測的訊號。

直接 ELISA

直接 ELISA 包括以下步驟

將待測抗原的緩衝溶液新增到微孔板的每個孔中，在那裡給予時間透過電荷相互作用吸附到塑膠上。
在孔中加入非反應性蛋白質溶液，例如牛血清白蛋白或酪蛋白，以覆蓋孔中未被抗原覆蓋的任何塑膠表面。
加入初級抗體，其特異性結合到覆蓋孔的測試抗原上。這種初級抗體也可以存在於供體血清中，以測試其對抗原的反應性。
加入二級抗體，它會結合初級抗體。這種二級抗體通常附著有酶，這對抗體的結合特性影響很小。在其他情況下，如圖 5 所示，初級抗體本身與酶偶聯。
然後加入這種酶的底物。通常，這種底物在與酶反應後會改變顏色。顏色變化表明二級抗體已與初級抗體結合，這強烈表明供體對測試抗原產生了免疫反應。這在臨床環境和研究中很有幫助。
血清中存在的初級抗體濃度越高，顏色變化越強。通常，使用光度計來給出顏色強度的定量值。

在文獻中，“直接 ELISA”和“間接 ELISA”這兩個名稱的用法和含義因實驗的背景而異。當分析抗原的存在時，“直接 ELISA”是指只使用標記的初級抗體的 ELISA，而“間接 ELISA”是指抗原與初級抗體結合，然後由標記的二級抗體檢測的 ELISA。在後一種情況下，夾心 ELISA 與間接 ELISA 明顯不同。當“初級”抗體是感興趣的，例如在免疫分析的情況下，這種抗體被二級抗體直接檢測，並且“直接 ELISA”適用於兩個抗體的設定。

夾心 ELISA

直接 ELISA 的一個主要缺點是抗原固定方法不具有特異性；當使用血清作為測試抗原的來源時，樣本中的所有蛋白質都可能粘附到微孔板孔中，因此血清中分析物的濃度很低，在與孔表面結合時必須與其他血清蛋白競爭。夾心 ELISA 透過使用針對測試抗原的捕獲抗體來解決這個問題，該抗體可以將測試抗原從血清的分子混合物中拉出來。這種捕獲抗體與表面的結合是夾心 ELISA 的第一步。在阻斷表面上的非特異性結合位點後，加入樣本，如果存在，抗原將與捕獲抗體結合。以下程式與直接 ELISA 相同。

使用純化的特異性抗體將抗原連線到塑膠上，消除了在測量之前從複雜混合物中純化抗原的需要，簡化了測定方法，並提高了測定的特異性和靈敏度。

競爭性ELISA

ELISA的第三種應用是透過競爭性結合。這種ELISA的步驟與前兩個例子略有不同。

將未標記的抗體新增到樣品中。如果樣品中含有抗原，它將被抗體結合。
然後將這些抗體/抗原複合物新增到抗原包被的孔中。
洗滌板，以去除未結合的抗體。樣品中抗原越多，形成的Ag-Ab複合物就越多，因此可用於結合孔中抗原的未結合抗體就越少。
加入針對初級抗體的次級抗體。這種第二抗體與酶偶聯。
加入底物，剩餘的酶會產生顯色或熒光訊號。
停止反應，以防止最終訊號飽和。

一些競爭性ELISA試劑盒包含酶聯抗原，而不是酶聯抗體。標記的抗原與樣品抗原（未標記）競爭初級抗體結合位點。樣品中抗原越少，保留在孔中的標記抗原就越多，訊號就越強。

ELISPOT

酶聯免疫斑點 (ELISPOT) 測定是一種廣泛用於監測人類和動物細胞免疫反應的方法，並在結核病診斷以及監測移植患者的移植物耐受或排斥方面找到了臨床應用。ELISPOT 技術已被證明是監測細胞介導免疫的最有效手段之一，因為它能夠靈敏而準確地檢測稀有抗原特異性 T 細胞（或 B 細胞），並且能夠在周圍血單核細胞 (PBMC) 群體中視覺化單個陽性細胞。

簡而言之，在適當的條件下，ELISPOT 測定允許視覺化單個活化或響應細胞的分泌產物。測定中產生的每個斑點代表一個單一的反應性細胞。因此，ELISPOT 測定提供定性（關於特定的細胞因子或其他分泌的免疫分子）和定量（測試群體中響應細胞的頻率）資訊。

在 ELISPOT 測定中，96 孔 PVDF 膜微孔板中的膜表面塗有捕獲抗體，該抗體與所測定細胞因子的特定表位結合。在細胞孵育和刺激步驟中，PBMC 與抗原一起接種到板的孔中，並在孔的膜表面形成單層。隨著抗原特異性細胞被啟用，它們釋放細胞因子，細胞因子在有機會擴散到培養上清液中或被蛋白酶降解並被旁觀細胞上的受體結合之前，直接被固定在膜表面上的抗體捕獲。隨後的檢測步驟將固定化的細胞因子視覺化為免疫斑點；本質上是活化細胞的分泌足跡。

ELISPOT 的實際檢測限通常取決於在測定孔中接種的細胞數量。通常，每個孔將使用 200,000 - 400,000 個 PBMC 進行測定，但通常使用高達一百萬個細胞來檢測罕見事件。ELISPOT 能夠檢測該群體中單個抗原陽性細胞。

原理

ELISPOT 測定採用與夾心 ELISA 技術非常相似的技術。單克隆（優先選擇更高的特異性）或多克隆捕獲抗體無菌塗覆到 PVDF（聚偏二氟乙烯）背襯的微孔板上。板通常用血清蛋白進行封閉，該血清蛋白與測定中的任何抗體均無反應。在此之後，將感興趣的細胞以不同的密度鋪板，並新增抗原或有絲分裂原，然後置於 37°C CO2 恆溫培養箱中培養指定時間。

活化細胞分泌的細胞因子（或其他感興趣的細胞產物）被塗覆在高表面積 PVDF 膜上的抗體區域性捕獲。在洗滌孔以去除細胞、碎屑和培養基成分後，將針對所選分析物的生物素化多克隆抗體新增到孔中。該抗體與靶細胞因子的不同表位反應，因此被用於檢測捕獲的細胞因子。在洗滌以去除任何未結合的生物素化抗體後，使用與酶偶聯的鏈黴親和素（辣根過氧化物酶 (HRP) 或鹼性磷酸酶 (AP)）和沉澱底物（例如 AEC、BCIP/NBT）將檢測到的細胞因子視覺化。有色終產物（一個斑點，通常是紅色（對於 HRP）或藍黑色（對於 AP））通常代表單個產生細胞因子的細胞。可以用手動計數（例如，用解剖顯微鏡）或使用自動讀取器來捕獲微孔影像並分析斑點數量和大小來計數斑點。

側流測試

側流測試，也稱為側流免疫層析測定，是一種簡單的裝置，用於檢測樣本中目標分析物的存在（或不存在），而無需專門的和昂貴的裝置，儘管許多實驗室應用存在，它們得到讀取裝置的支援。通常，這些測試用於醫療診斷。一種廣泛傳播且眾所周知的應用是家庭妊娠測試。

該技術基於一系列毛細血管床，例如多孔紙或燒結聚合物。這些元素中的每一個都具有自發輸送液體（例如尿液）的能力。第一個元素（樣品墊）充當海綿，並容納過量的樣本液體。浸泡後，液體遷移到第二個元素（偶聯墊），製造商在其中儲存了所謂的偶聯物，即生物活性顆粒的乾燥形式，包含在鹽糖基質中，其中包含保證目標分子（例如，抗原）與其化學伴侶（例如，抗體）之間發生最佳化化學反應所需的一切，該化學伴侶已固定在顆粒表面。當樣本液體溶解鹽糖基質時，它也會溶解顆粒，並且在一個組合的傳輸動作中，樣本和偶聯物混合，同時流過多孔結構。透過這種方式，分析物在遷移透過第三個毛細血管床時與顆粒結合。該材料有一個或多個區域（通常稱為條帶），其中已固定第三個分子。當樣本偶聯物混合物到達這些條帶時，分析物已結合到顆粒上，並且第三個“捕獲”分子結合該複合物。一段時間後，當越來越多的液體透過條帶時，顆粒會積聚，並且條帶區域會變色。通常，至少有兩個條帶：一個（對照）捕獲任何顆粒，從而表明反應條件和技術工作正常，另一個包含特定的捕獲分子，並且僅捕獲那些已固定有分析物分子的顆粒。在透過這些反應區後，液體進入最終的多孔材料（吸液芯），該材料僅充當廢物容器。側流測試可以作為競爭性測定或夾心測定來執行。