生命科學方法與概念/核酸分離
從細菌中分離質粒 DNA 包括三個步驟
- 細菌培養的生長
- 細菌的收穫和裂解
- 質粒 DNA 的純化
含有感興趣質粒的細菌通常在含有抗生素的培養基中過夜培養，該抗生素適合質粒。然後，對樣品進行離心，以將細胞物質（包括 DNA）濃縮到容器底部形成沉澱。去除上清液，然後將沉澱物懸浮在含有 EDTA 的生理緩衝液中。EDTA 的作用是螯合二價金屬陽離子，如 Mg2+ 和 Ca2+，這些陽離子是 DNA 降解酶 (DNAses) 功能所必需的，還有助於穩定 DNA 磷酸骨架。
隨後，加入強鹼性溶液（pH 12.0-12.5），該溶液由去垢劑十二烷基硫酸鈉 (SDS) 和強鹼，如氫氧化鈉 (NaOH) 組成。去垢劑破壞細胞膜，鹼使染色體 DNA 和質粒 DNA 變性。
最後，加入醋酸鉀。這會酸化溶液，並允許質粒 DNA 復性。然而，較大且超螺旋程度較低的染色體 DNA 會與蛋白質和去垢劑一起沉澱。進行最終離心，這次沉澱物只包含碎片，可以丟棄。另一方面，含有質粒的上清液可以在後續步驟中純化。這種裂解方法被稱為鹼性裂解。
核酸純化的傳統方法是苯酚-氯仿提取。簡而言之，將水性樣品與等體積的苯酚：氯仿混合物混合。混合後，將混合物離心，形成兩個不同的相，因為苯酚：氯仿混合物與水不相混溶。水相在上層，因為它比有機相（苯酚：氯仿）密度低。蛋白質將分配到下層有機相中，而核酸（以及其他汙染物，如鹽、糖等）將保留在上層水相中。小心地吸取上層水相，並注意不要吸取任何有機相或介面處的物質。此過程通常執行多次，以提高 DNA 的純度。
如果混合物呈酸性，DNA 會沉澱到有機相中，而 RNA 則保留在水相中，因為 DNA 比 RNA 更容易中和。
如今，試劑盒通常用於分離質粒 DNA。這些試劑盒的命名方式是根據細菌培養物的規模和相應的質粒產量。按順序排列，分別是迷你製備、中製備、最大製備、超大製備和巨型製備。
迷你製備試劑盒將鹼性裂解與透過矽膠基旋轉柱進行的質粒純化結合在一起。在高鹽濃度下，帶正電的離子可以在帶負電的 DNA 和帶負電的矽膠基質之間形成鹽橋。小核酸（最多 70 bp）和蛋白質可以使用含有高鹽濃度的乙醇溶液洗脫。之後，質粒 DNA 用水或 TE 緩衝液洗脫。