蛋白質結構測定

在蛋白質資料庫中，約 90% 的蛋白質結構是透過 X射線晶體學確定的。這種方法可以測量蛋白質在結晶狀態下電子的三維 (3-D) 密度分佈，從而推斷所有原子的 3-D 座標，並確定到一定解析度。約 9% 的已知蛋白質結構是透過核磁共振技術獲得的。可以透過圓二色性測定二級結構組成。振動光譜也可以用來表徵肽、多肽和蛋白質的構象。近年來，冷凍電鏡已成為確定蛋白質結構的一種手段，解析度高達 5 埃或 0.5 奈米，預計在未來十年中，它將作為一種高解析度工作工具而變得更加強大。

X射線晶體學

X射線晶體學是一種用來識別晶體原子和分子結構的工具，其中晶體原子會導致入射 X射線束衍射成許多特定的方向。透過測量這些衍射光束的角度和強度，晶體學家可以產生晶體中電子密度的三維影像。從這種電子密度中，可以確定晶體中原子平均位置，以及它們的化學鍵、無序度和各種其他資訊。

在單晶 X射線衍射測量中，將晶體安裝在測角儀上。測角儀用於將晶體定位在選定的方向。用細聚焦的單色 X射線束轟擊晶體，產生規律間隔的斑點，稱為反射。在不同旋轉角度拍攝的二維影像透過傅立葉變換的數學方法，結合樣品已知的化學資料，轉換成晶體中電子密度的三維模型。如果晶體太小，或者內部結構不均勻，則會導致解析度差（模糊）甚至錯誤。

結晶

晶體學通常需要高度規則的純晶體來解析複雜的原子排列結構。蛋白質晶體幾乎總是生長在溶液中。最常見的方法是逐漸降低其組成分子的溶解度；如果這樣做太快，分子將從溶液中析出，在容器底部形成無用的粉塵或無定形凝膠。溶液中晶體生長有兩個步驟：成核形成一個微觀晶體（可能只有 100 個分子），然後是生長，理想情況下會生長到一個衍射級晶體。有利於第一步（成核）的溶液條件並不總是與有利於第二步（後續生長）的溶液條件相同。晶體學家的目標是確定有利於單個大晶體形成的溶液條件，因為較大的晶體可以提供分子解析度的提高。因此，溶液條件應不利於第一步（成核），但有利於第二步（生長），這樣每個液滴中只形成一個大晶體。如果成核過於有利，液滴中將形成許多小晶體，而不是一個大晶體；如果成核不利，則根本不會形成晶體。

很難預測良好有序晶體成核或生長的良好條件。在實踐中，可以透過篩選來確定有利條件；製備一大批目標分子，並測試各種結晶溶液。在找到成功的條件之前，通常要嘗試數百種甚至數千種溶液條件。各種條件可以使用一種或多種物理機制來降低分子的溶解度；例如，一些條件會改變 pH 值，一些條件會包含霍夫邁斯特級數的鹽或降低溶液介電常數的化學物質，還有一些條件會包含大分子聚合物（如聚乙二醇），這些聚合物透過熵效應將分子從溶液中驅除出去。也經常嘗試使用幾種溫度來鼓勵結晶，或者逐漸降低溫度，使溶液過飽和。這些方法需要大量的目標分子，因為它們使用高濃度的分子來結晶。由於難以獲得大量（毫克級）的結晶級蛋白質，因此開發了機器人，能夠準確地分配結晶試驗滴，體積約為 100 納升。這意味著與手工設定的結晶試驗（約 1 微升）相比，每次實驗使用的蛋白質減少了 10 倍。

已知有幾種因素會抑制或損害結晶。生長中的晶體通常保持在恆定溫度下，並防止震動或振動，這些震動或振動可能會干擾它們的結晶。分子或結晶溶液中的雜質通常不利於結晶。分子中的構象柔性也會使結晶變得不太可能，這是由於熵效應。如果未能使目標分子結晶，晶體學家可能會嘗試使用稍微修飾的分子版本再次進行嘗試；即使分子性質發生細微變化也會導致結晶行為發生巨大差異。

資料收集

晶體被安裝以便進行測量，這樣它就可以被放置在 X射線束中並旋轉。蛋白質晶體用一個環狀物舀起，然後用液氮快速冷凍。這種冷凍減少了 X射線的輻射損傷，以及由熱運動（德拜-瓦勒效應）引起的布拉格峰的噪聲。然而，未經處理的蛋白質晶體在快速冷凍時通常會破裂；因此，它們通常在冷凍前先浸泡在冷凍保護劑溶液中。不幸的是，這種預浸泡本身會導致晶體破裂，使其不適合晶體學。通常，成功的低溫條件是透過反覆試驗確定的。

毛細管或環狀物安裝在測角儀上，使它能夠準確地定位在 X射線束中並旋轉。由於晶體和光束都很小，因此必須將晶體在光束內中心對準，精度約為 25 微米，這可以透過聚焦在晶體上的相機來幫助完成。最常見的測角儀型別是“卡帕測角儀”，它提供三個旋轉角度：ω 角，繞垂直於光束的軸旋轉；κ 角，繞與 ω 軸成約 50° 的軸旋轉；最後，φ 角繞環狀物/毛細管軸旋轉。在資料收集過程中進行的振盪（下面提到）只涉及 ω 軸。

然後用一束單色 X射線照射安裝好的晶體。最亮、最有用 X射線源是同步輻射加速器；它們的光亮度高得多，可以實現更好的解析度。它們也方便調節輻射波長，這在多波長反常色散相位確定（下面描述）中很有用。同步輻射加速器通常是國家級設施，每個設施都有多個專門的光束線，這些光束線全天候、一週七天不間斷地收集資料。

更小的 X射線發生器通常用於實驗室，在將晶體送到同步輻射加速器之前檢查晶體的質量，有時也用於解決晶體結構。

X 射線通常會先經過濾波（使用 X 射線濾波器）以獲得單一波長（單色化）並準直為單一方向，然後再照射到晶體上。濾波不僅簡化了資料分析，而且還去除了不會提供有用資訊，反而會降解晶體的輻射。

當將晶體安裝並暴露於強 X 射線束中時，它會將 X 射線散射到一系列斑點或反射中，這些斑點可以在晶體後面的螢幕上觀察到。用雷射筆照射光碟也能看到類似的圖案。這些斑點的相對強度提供了資訊，可以確定晶體中分子在原子細節上的排列。這些反射的強度可以用照相底片、面積探測器或電荷耦合器件 (CCD) 影像感測器記錄。小角度的峰對應於低解析度資料，而大角度的峰對應於高解析度資料；因此，可以從前幾個影像中確定結構最終解析度的上限。此時，可以確定衍射質量的一些指標，例如晶體的鑲嵌度及其在峰寬中觀察到的整體無序度。此時，也可以快速診斷出不適合解決結構的晶體的某些病理。

單個斑點影像不足以重建整個晶體；它只代表了完整傅立葉變換的一小部分。為了收集所有必要的資訊，必須將晶體逐步旋轉 180°，並在每一步記錄影像。實際上，由於埃瓦爾德球的曲率，需要略大於 180° 來覆蓋倒空間。但是，如果晶體具有更高的對稱性，則可以記錄更小的角度範圍，例如 90° 或 45°。應至少更改一次旋轉軸，以避免在接近旋轉軸的倒空間中形成“盲點”。習慣上稍微搖動晶體（0.5-2°），以捕獲倒空間的更廣區域。

某些相位方法可能需要多個數據集。例如，MAD 相位需要至少記錄三種（通常是四種，為了冗餘）入射 X 射線輻射波長下的散射。單個晶體在收集一個數據集期間可能會因輻射損傷而過度降解；在這種情況下，必須對多個晶體進行資料集採集。

資料分析

晶體對稱性、晶胞和影像縮放

記錄的二維衍射圖系列，每個對應於不同的晶體取向，被轉換為晶體電子密度的三維模型。轉換使用傅立葉變換的數學技術。每個斑點對應於電子密度中的不同型別的變化；晶體學家必須確定哪個變化對應於哪個斑點（索引）、不同影像中斑點的相對強度（合併和縮放）以及如何將這些變化組合起來以產生總電子密度（相位）。

資料處理從索引反射開始。這意味著識別晶胞的尺寸以及哪個影像峰對應於倒空間中的哪個位置。索引的副產品是確定晶體的對稱性，即它的空間群。一些空間群可以從一開始就被排除在外。例如，在手性分子中無法觀察到反射對稱性；因此，在幾乎總是手性的蛋白質分子中，230 個可能的空間群中只有 65 個是允許的。索引通常使用自動索引程式完成。確定對稱性後，資料將被積分。這將包含數千個反射的數百個影像轉換為單個檔案，該檔案至少包含每個反射的米勒指數記錄以及每個反射的強度（在該狀態下，該檔案通常還包括誤差估計和部分性測量（哪個部分給定反射記錄在該影像上））。

完整的資料集可能包含數百個在不同晶體取向上拍攝的單獨影像。第一步是合併和縮放這些不同的影像，即確定哪些峰出現在兩個或多個影像中（合併）並將相對影像進行縮放，以便它們具有一致的強度比例。最佳化強度比例至關重要，因為峰的相對強度是確定結構的關鍵資訊。晶體學資料收集的重複技術以及晶體材料通常的高對稱性會導致衍射儀多次記錄許多對稱等效反射。這使得可以計算對稱相關的 R 因子，這是一個基於對稱等效反射的測量強度相似程度的可靠性指標，從而評估資料的質量。

初始相位

從衍射實驗中收集的資料是晶格的倒空間表示。每個衍射“斑點”的位置受晶胞的大小和形狀以及晶體中固有的對稱性的控制。記錄每個衍射“斑點”的強度，該強度與結構因子幅度的平方成正比。結構因子是一個複數，包含與波的幅度和相位相關的資訊。為了獲得可解釋的電子密度圖，必須知道幅度和相位（電子密度圖允許晶體學家構建分子的起始模型）。相位無法在衍射實驗中直接記錄：這被稱為相位問題。可以透過多種方法獲得初始相位估計

從頭算相位或直接方法：這通常是針對小分子（<1000 個非氫原子）的首選方法，並已成功用於解決小蛋白質的相位問題。如果資料的解析度優於 1.4 Å，則可以使用直接方法透過利用某些反射組之間的已知相位關係來獲得相位資訊。
分子置換：如果知道相關的結構，則可以在分子置換中將其用作搜尋模型，以確定分子在晶胞中的取向和位置。透過這種方式獲得的相位可用於生成電子密度圖。
反常 X 射線散射（MAD 或 SAD 相位）：X 射線波長可以掃描經過原子的吸收邊，這會以已知的方式改變散射。透過在三個不同波長（遠低於、遠高於和位於吸收邊中間）記錄完整的反射集，可以求解反常衍射原子的子結構，進而求解整個分子的結構。將反常散射原子摻入蛋白質中最流行的方法是在富含硒代蛋氨酸的培養基中表達蛋白質，該培養基含有硒原子，該培養基在蛋氨酸營養缺陷型（無法合成蛋氨酸的宿主）中表達蛋白質。然後可以在吸收邊附近進行 MAD 實驗，這應該可以得出蛋白質中任何蛋氨酸殘基的位置，從而提供初始相位。
重原子方法（多重同晶置換）：如果可以在晶體中引入電子緻密的金屬原子，則可以使用直接方法或帕特森空間方法來確定它們的位置並獲得初始相位。可以透過將晶體浸泡在含重原子的溶液中或透過共結晶（在重原子的存在下生長晶體）來引入這些重原子。與 MAD 相位一樣，散射幅度的變化可以被解釋以產生相位。雖然這是最初解決蛋白質晶體結構的方法，但它在很大程度上已被使用硒代蛋氨酸的 MAD 相位所取代。

模型構建和相位精修

獲得初始相位後，可以構建初始模型。此模型可用於精修相位，從而導致改進的模型，依此類推。給定一些原子位置的模型，可以精修這些位置及其各自的德拜-瓦勒因子（或B 因子，考慮原子的熱運動）以擬合觀察到的衍射資料，理想情況下會產生更好的相位集。然後可以將新模型擬合到新的電子密度圖中，並進行進一步的精修。這將持續進行，直到衍射資料和模型之間的相關性最大化。一致性由R因子衡量，該因子定義為

R={\frac {\sum {||F_{\text{obs}}|-|F_{\text{calc}}||}}{\sum {|F_{\text{obs}}|}}}

其中F表示結構因子。類似的質量指標是Rfree，它是根據結構最佳化中未包含的反射子集（約10%）計算得出的。R因子都取決於資料的解析度。經驗法則是，Rfree應大致等於以埃為單位的解析度除以10；因此，解析度為2 Å的資料集應該產生最終的Rfree ~ 0.2。化學鍵特徵，如立體化學、氫鍵以及鍵長和鍵角的分佈，是模型質量的補充指標。相位偏差在迭代模型構建中是一個嚴重問題。省略圖是用於檢查此問題的一種常用技術。

可能無法觀察到結晶分子中的每個原子——必須記住，得到的電子密度是晶體中所有分子的平均值。在某些情況下，這些原子存在過多的殘餘無序，並且由於多個構象而存在的原子的電子密度被擴散到無法在電子密度圖中檢測到的程度。氫等弱散射原子通常是不可見的。一個原子也可能在電子密度圖中多次出現，例如，如果蛋白質側鏈具有多個（< 4）允許的構象。在其他情況下，晶體學家可能會發現，為分子推斷的共價結構是不正確的，或者發生了改變。例如，蛋白質可能被切割或經歷了在結晶之前未檢測到的翻譯後修飾。

核磁共振波譜

核磁共振波譜，通常被稱為核磁共振波譜，是一種利用某些原子核磁性的研究技術。它確定原子或包含它們的分子物理和化學性質。它依賴於核磁共振現象，可以提供有關分子結構、動力學、反應狀態和化學環境的詳細資訊。分子中原子周圍的分子內磁場改變了共振頻率，從而可以瞭解分子的電子結構細節。這些性質的測量提供了一個地圖，顯示原子如何以化學方式連線，它們在空間中如何接近，以及它們相對於彼此的運動速度。

這些性質從根本上與更熟悉的磁共振成像 (MRI) 中使用的性質相同，但分子應用使用的是略微不同的方法，適用於從毫米（放射科醫生感興趣的尺度）到奈米（鍵合原子通常相隔奈米的一部分）的尺度變化，因子為一百萬。這種尺度變化需要更高的檢測靈敏度和長期測量的穩定性。與MRI不同的是，結構生物學研究不會直接生成影像，而是依賴複雜的計算機計算來生成三維分子模型。

目前，大多數樣本是在水溶液中進行檢測的，但正在開發的方法也可以用於處理固體樣本。資料收集依賴於將樣品放置在強大的磁體中，透過樣品傳送射頻訊號，並測量這些訊號的吸收。根據蛋白質中原子的環境，單個原子的原子核將吸收不同的射頻訊號頻率。此外，不同原子核的吸收訊號可能會受到相鄰原子核的擾動。此資訊可用於確定原子核之間的距離。這些距離反過來可用於確定蛋白質的整體結構。

基本的核磁共振技術

當置於磁場中時，核磁共振活性核（如 1H 或 13C）會在其同位素特徵頻率下吸收電磁輻射。共振頻率、吸收能量和訊號強度與磁場強度成正比。

光譜採集

用射頻脈衝激發樣品後，獲得核磁共振響應——自由感應衰減 (FID)。它是一個非常微弱的訊號，需要靈敏的無線電接收器才能接收。進行傅立葉變換以從原始時域 FID 中提取頻域光譜。來自單個 FID 的光譜具有低信噪比，但幸運的是，透過對重複採集進行平均，信噪比可以很容易地提高。良好的 1H 核磁共振光譜可以透過 16 次重複採集獲得，這隻需要幾分鐘。然而，對於比氫更重的元素，弛豫時間相當長，例如 13C 大約為 8 秒。因此，定量重元素光譜的採集可能很耗時，需要花費幾十分鐘到幾小時。如果在弛豫完成之前過早地傳送第二個激發脈衝，平均磁化向量仍然指向非平行方向，導致脈衝的吸收和發射不理想。

化學位移

旋轉的電荷會產生磁場，從而產生與自旋成正比的磁矩。在外部磁場存在的情況下，存在兩種自旋狀態（對於自旋為 1/2 的原子核）：一個自旋向上，一個自旋向下，其中一個與磁場對齊，另一個與磁場相反。兩種自旋狀態之間的能量差 (ΔE) 隨著場強度的增加而增加，但這種差異通常非常小，導致需要強核磁共振磁體（現代核磁共振儀器為 1-20 T）。用對應於特定原子核組的精確自旋狀態分離的能量照射樣品，會導致處於較低能態的該組原子核被激發到較高能態。

對於自旋為 1/2 的原子核，在給定磁場強度下，兩種自旋狀態之間的能量差與其磁矩成正比。然而，即使所有質子具有相同的磁矩，它們也不會在相同的頻率值處給出共振訊號。這種差異源於感興趣的原子核的不同電子環境。在施加外部磁場後，這些電子會響應磁場而移動，併產生區域性磁場，該磁場會抵消更強的施加磁場。因此，該區域性場“遮蔽”質子免受施加磁場的影響，因此必須增加施加磁場才能達到共振（吸收射頻能量）。這些增量非常小，通常以百萬分率 (ppm) 表示。例如，醛的質子峰與烴峰相比偏移了約 10 ppm，因為作為吸電子基團，羰基透過降低區域性電子密度而遮蔽質子。

鑑於不同核磁共振訊號的位置取決於外部磁場強度和參考頻率，因此這些訊號通常相對於參考訊號（通常是 TMS（四甲基矽烷））進行報告。此外，由於核磁共振訊號的分佈與場有關，因此這些頻率除以光譜儀頻率。但是，由於我們用 MHz 除以 Hz，得到的結果會太小，因此乘以一百萬。因此，此操作給出了一個稱為化學位移的定位數，其單位為百萬分率。為了檢測如此微小的頻率差異，施加的磁場必須在整個樣品體積內保持恆定。高解析度核磁共振光譜儀使用梯度線圈來調整磁場均勻性，使其達到十億分率 (ppb)，在幾立方厘米的體積內。一般來說，質子的化學位移是高度可預測的，因為位移主要由更簡單的遮蔽效應（電子密度）決定，但許多重原子核的化學位移受其他因素的影響更大，包括激發態（“順磁性”對遮蔽張量的貢獻）。

化學位移提供了有關分子結構的資訊。將原始資料轉換為該資訊的處理過程稱為譜圖歸屬。例如，對於乙醇 (CH3CH2OH) 的 1H-NMR 譜圖，人們會期望在三個特定的化學位移處出現訊號：一個對應於 CH3 基團，一個對應於 CH2 基團，還有一個對應於 OH 基團。一個典型的 CH3 基團的位移約為 1 ppm，與 OH 相連的 CH2 的位移約為 4 ppm，而 OH 的位移則在 2–6 ppm 之間，具體取決於所用溶劑和氫鍵的程度。雖然 O 原子確實透過它們共同的 sigma 鍵從相連的 H 上拉走了電子密度，但 O 上的電子孤對則對 H 產生遮蔽效應。由於室溫下的分子運動，三個甲基質子在 NMR 實驗（通常需要幾毫秒）中平均化。這些質子變得簡併，並在相同的化學位移處形成一個峰。

峰的形狀和麵積也是化學結構的指示器。在上面的例子中——乙醇的質子譜——CH3 峰的面積是 OH 峰的三倍。同樣，CH2 峰的面積將是 OH 峰的兩倍，但僅為 CH3 峰的 2/3。

軟體允許分析峰的訊號強度，在最佳弛豫條件下，與該型別質子的數量相關。分析人員必須積分峰值，而不是測量其高度，因為峰值也具有寬度——因此其大小取決於其面積，而不是其高度。然而，應該指出的是，質子或任何其他觀察到的核的數量僅與最簡單的單維 NMR 實驗中的 NMR 訊號的強度或積分成正比。在更復雜的實驗中，例如，通常用於獲得碳-13 NMR 譜圖的實驗中，訊號的積分取決於核的弛豫速率及其標量和偶極耦合常數。這些因素往往是未知的 - 因此，在更復雜的 NMR 實驗中很難解釋 NMR 訊號的積分。

J 耦合

在一維 NMR 譜圖中，用於結構測定的最有用資訊來自於 NMR 活性核之間的J 耦合或標量耦合（自旋-自旋耦合的一種特殊情況）。這種耦合源於不同自旋態透過分子化學鍵的相互作用，導致 NMR 訊號分裂。這些分裂模式可能很複雜，也可能很簡單，同樣，也可能易於理解或具有欺騙性。這種耦合提供了關於分子中原子連線的詳細見解。

耦合到n個等效（自旋 ½）核將訊號分裂成一個n+1個多重峰，其強度比遵循帕斯卡三角形。耦合到額外的自旋將導致多重峰的每個組分進一步分裂，例如耦合到兩個具有明顯不同耦合常數的不同自旋 ½ 核將導致一個雙重峰（縮寫：dd）。請注意，化學等效（即具有相同的化學位移）的核之間的耦合對 NMR 譜圖沒有影響，而遙遠核之間的耦合（通常對於柔性分子中的質子而言，超過 3 個鍵）通常太小而無法引起可觀察到的分裂。長程耦合通常可以在環狀和芳香族化合物中觀察到，超過三個鍵，導致更復雜的裂分模式。

例如，在上面描述的乙醇的質子譜中，CH3 基團被兩個相鄰的 CH2 質子分裂成一個三重峰，強度比為 1:2:1。類似地，CH2 被三個相鄰的 CH3 質子分裂成一個四重峰，強度比為 1:3:3:1。原則上，兩個 CH2 質子也會被羥基質子再次分裂成一個雙重峰，形成一個四重峰的雙重峰，但酸性羥基質子的分子間交換通常會導致耦合資訊的丟失。

耦合到任何自旋 ½ 核，如磷-31 或氟-19，都是以這種方式進行的（儘管耦合常數的大小可能非常不同）。但自旋大於 ½ 的核的分裂模式不同於上面描述的模式，因為自旋量子數具有兩個以上的可能值。例如，耦合到氘（一個自旋為 1 的核）將訊號分裂成一個1:1:1 三重峰，因為自旋 1 有三個自旋態。類似地，一個自旋 3/2 核將一個訊號分裂成一個1:1:1:1 四重峰，等等。

耦合結合化學位移（以及質子的積分）不僅告訴我們關於核的化學環境的資訊，還告訴我們關於分子內相鄰 NMR 活性核的數量的資訊。在更復雜的譜圖中，具有類似化學位移的多個峰，或在氫以外的核的譜圖中，耦合通常是區分不同核的唯一方法。

二維 NMR 光譜學

二維 NMR 是一組 NMR 方法，它提供的資料繪製在一個由兩個頻率軸而不是一個頻率軸定義的空間中。二維 NMR 譜圖提供的資訊比一維 NMR 譜圖更多，特別適用於確定分子的結構，特別是對於使用一維 NMR 難以處理的複雜分子。

每個實驗都包含一系列射頻 (RF) 脈衝，它們之間有延遲時間。正是這些脈衝的定時、頻率和強度將不同的 NMR 實驗彼此區分開來。幾乎所有的二維實驗都有四個階段：準備階段，透過一組 RF 脈衝產生磁化相干性；演化階段，一個確定的時間長度，在此期間不提供脈衝，核自旋被允許自由進動（旋轉）；混合階段，透過另一組脈衝將相干性操作到一種狀態，該狀態將產生可觀察到的訊號；以及檢測階段，在該階段，觀察到樣品的自由感應衰減訊號隨時間的函式。

二維 NMR 實驗的兩個維度是代表化學位移的兩個頻率軸。每個頻率軸都與兩個時間變數中的一個相關聯，這兩個時間變數分別是演化週期的長度（演化時間）和檢測週期內經過的時間（檢測時間）。它們都是透過二維傅立葉變換從時間序列轉換為頻率序列。單個二維實驗是作為一系列一維實驗生成的，在連續的實驗中具有不同的特定演化時間，並且在每個實驗中記錄檢測週期的整個持續時間。

最終結果是一個圖，顯示每個頻率變數對的強度值。譜圖中峰的強度可以使用第三維度表示。更常見的是，強度用等高線或不同的顏色表示。

同核透過鍵相關方法

在這些方法中，磁化傳遞發生在相同型別的核之間，透過連線最多幾個鍵的核的 J 耦合。

在標準 COSY 中，準備（p1）和混合（p2）階段分別包含一個單一的 90° 脈衝，它們之間隔著演化時間 t1，並且在檢測階段，在各種時間 t2 上讀取樣品的共振訊號。

第一個也是最流行的二維 NMR 實驗是同核相關光譜 (COSY) 序列，它用於識別彼此耦合的自旋。

COSY 實驗產生的二維譜圖顯示了單個同位素的頻率，最常見的是氫 (1H)，沿著兩個軸。COSY 譜圖顯示兩種型別的峰。對角峰在每個軸上具有相同的頻率座標，並沿圖的對角線出現，而交叉峰在每個頻率座標上具有不同的值，並偏離對角線出現。對角峰對應於一維 NMR 實驗中的峰，而交叉峰表示成對核之間的耦合（就像多重峰分裂在一維 NMR 中表示耦合一樣）。

全相關光譜 (TOCSY) 類似於 COSY，因為觀察到耦合質子的交叉峰。但是，不僅觀察到直接耦合的核之間的交叉峰，而且觀察到透過耦合鏈連線的核之間的交叉峰。這使得它有助於識別更大的相互連線的自旋耦合網路。這種能力是透過插入一系列重複的脈衝來實現的，這些脈衝在混合階段引起各向同性混合。更長的各向同性混合時間會導致極化透過越來越多的鍵傳播開來。

異核透過鍵相關方法

異核相關光譜根據兩個不同型別的核之間的耦合給出訊號。通常，這兩個核是質子和另一個核（稱為“異核”）。

蛋白 NleG3-2 片段的 ¹H–¹⁵N HSQC 譜圖。譜圖中的每個峰代表一個成鍵的 N-H 對，其兩個座標對應於 H 和 N 原子的每個原子的化學位移。一些峰用給出該訊號的氨基酸殘基標記。

異核單量子相關光譜 (HSQC) 檢測兩個不同型別的核之間的相關性，它們被一個鍵隔開。該方法為每一對耦合核提供一個峰，其兩個座標是兩個耦合原子的化學位移。

HSQC 透過使用 INEPT 脈衝序列將磁化從S（敏感）核（通常是質子）轉移到I（不敏感）核（通常是雜原子）來工作；第一步是完成的，因為質子具有更大的平衡磁化，因此此步驟產生更強的訊號。然後磁化演化，然後轉移回S核以進行觀察。然後可以可選地使用額外的自旋迴波步驟來解耦訊號，透過將多重峰摺疊成單個峰來簡化譜圖。透過使用一個特定脈衝的相位反轉兩次執行實驗來消除不需要的未解耦訊號；這反轉了所需峰的符號，而不是不需要的峰的符號，因此減去兩個譜圖將只給出所需峰。

15N HSQC 實驗是蛋白質 NMR 中最常記錄的實驗之一。除了脯氨酸以外，蛋白質的每個殘基都有一個連線到肽鍵中的氮的醯胺質子。HSQC 提供了氮和醯胺質子之間的相關性，每個醯胺在 HSQC 譜圖中產生一個峰。

透過空間相關方法

這些方法建立了原子核之間的相關性，這些原子核在空間上彼此靠近，無論它們之間是否存在化學鍵。它們利用核Overhauser效應（NOE），即附近的原子（約5埃以內）透過與自旋-晶格弛豫相關的機制發生交叉弛豫。

在 **核Overhauser效應譜（NOESY）** 中，混合期間核自旋之間的核Overhauser交叉弛豫被用來建立相關性。所獲得的光譜類似於COSY，具有對角線峰和交叉峰，但是交叉峰連線來自空間上靠近的原子核的共振，而不是那些透過鍵耦合的原子核。NOESY光譜還包含額外的 *軸向峰*，這些峰不會提供額外的資訊，可以透過反轉第一個脈衝的相位來消除。

NOESY的一個應用是研究大型生物分子，如蛋白質核磁共振，它通常可以透過順序行走來分配。

步驟

蛋白質核磁共振是在高度純化的蛋白質水溶液中進行的。與X射線晶體學不同，核磁共振譜通常僅限於小於35 kDa的蛋白質，雖然更大的結構已被解決。核磁共振譜通常是獲得部分或完全內在無結構蛋白質的高解析度資訊的唯一方法。為了便於實驗，希望用13C和15N同位素標記蛋白質，因為主要的天然同位素12C不是核磁共振活性的，而主要的天然同位素14N的核四極矩阻止了從該氮同位素獲得高解析度資訊。

為了分析核磁共振資料，重要的是獲得蛋白質的共振分配，即找出哪個化學位移對應於哪個原子。這通常透過使用從幾種不同型別的NMR實驗中獲得的資訊進行順序行走來實現。具體步驟取決於蛋白質是否被同位素標記，因為許多分配實驗依賴於碳-13和氮-15。

為了進行結構計算，需要生成許多實驗確定的約束條件。這些約束條件分為不同的類別，其中最廣泛使用的是距離約束和角度約束。例如，NOESY實驗中的交叉峰表示兩個原子核在空間上的接近。因此，每個峰可以轉換為兩個原子核之間的最大距離，通常在1.8到6埃之間。NOESY峰的強度與距離的負6次方成正比，因此距離是根據峰的強度來確定的。強度-距離關係並不精確，因此通常使用距離範圍。

實驗確定的約束條件可以用作結構計算過程的輸入。研究人員試圖滿足儘可能多的約束條件，以及蛋白質的一般性質，如鍵長和鍵角。該演算法將約束條件和蛋白質的一般性質轉換為能量項，並試圖最小化能量。該過程會生成一系列結構，如果資料足以確定一個特定的摺疊，這些結構將收斂。