生命科學方法與概念/光譜學
光譜學是研究物質與電磁輻射相互作用的學科。從歷史上看，光譜學起源於對可見光根據其波長透過稜鏡分散的研究。後來，這一概念得到了極大的擴充套件，包括了任何與輻射能量作為其波長或頻率的函式的相互作用。
吸收光譜指的是測量由於與樣品相互作用而導致的輻射吸收作為頻率或波長的函式的光譜技術。樣品吸收能量，即光子，來自輻射場。吸收強度隨頻率而變化，這種變化就是吸收光譜。
吸收光譜被用作一種工具來確定樣品中特定物質的存在，並且在許多情況下，來量化樣品中存在物質的量。紅外和紫外-可見光譜在分析應用中尤其常見。吸收光譜也被用於分子和原子物理學、天體光譜學和遙感的研究中。
有各種各樣的實驗方法來測量吸收光譜。最常見的排列是將生成的輻射束指向樣品，並檢測穿過樣品的輻射強度。透射能量可用於計算吸收。光源、樣品排列和檢測技術根據頻率範圍和實驗目的而有很大差異。
吸收線通常根據在分子或原子中誘導的量子力學變化的性質進行分類。例如，旋轉線發生在分子旋轉狀態發生變化時。旋轉線通常在微波光譜區域中找到。振動線對應於分子振動狀態的變化，並且通常在紅外區域中找到。電子線對應於原子或分子的電子狀態的變化，並且通常在可見光和紫外區域中找到。X射線吸收與原子內層電子的激發有關。這些變化也可以組合（例如旋轉-振動躍遷），導致新的吸收線出現在兩種變化的組合能量處。
與量子力學變化相關的能量主要決定了吸收線的頻率，但頻率可以被幾種型別的相互作用所改變。電場和磁場會導致偏移。與相鄰分子的相互作用會導致偏移。例如，當氣相分子處於液相或固相中並與相鄰分子更強烈地相互作用時，氣相分子的吸收線會發生明顯偏移。
比爾-朗伯定律將光的衰減與光穿過的物質的性質聯絡起來。
當光穿過樣品時，其強度會下降。這種下降與物質的濃度c、強度I和一個稱為ε'的常數成正比。
這等於
並且可以積分
路徑長度 x-x0 通常稱為d。該方程可以轉換為指數函式，該函式描述了光穿過樣品時強度下降的情況。
在先前方程中將自然對數改為常用對數將得到比爾-朗伯定律的常見形式。
其中 ε 是摩爾衰減係數。該係數衡量的是特定化學物質在給定波長下吸收光的強弱。ε 的 SI 單位為 m2/mol，但在實際應用中，通常以 M−1 cm−1 或 L mol−1 cm−1 計量。在較早的文獻中，有時會使用 cm2 mol−1，對應的數值會大 1000 倍。
在生物化學中，蛋白質在 280 nm 處的消光係數幾乎完全取決於芳香殘基的數量，特別是色氨酸，並且可以透過氨基酸序列預測。如果已知消光係數，則可以用來確定溶液中蛋白質的濃度。當溶液中存在多種吸收物質時，總吸光度是每種物質吸光度的總和。
| 最大吸收波長 / nm | ε / M-1 cm-1 | |
|---|---|---|
| 肽鍵 | 190 | 7000 |
| 215 | 100 | |
| 色氨酸 | 280 | 5600 |
| 酪氨酸 | 275 | 1500 |
| 苯丙氨酸 | 250 | 220 |
| 二硫鍵 | 250 | 300 |
紫外可見光譜法中使用的儀器稱為 UV/Vis **分光光度計**。分光光度計的基本部件包括光源、樣品架、單色儀中的衍射光柵或稜鏡（用於分離不同波長的光）以及檢測器。輻射源通常是氘弧燈，它在紫外區域（190-400 nm）內是連續的，也可以是氙弧燈，或者更近期的發光二極體 (LED) 用於可見光波長。檢測器通常是光電倍增管、光電二極體、光電二極體陣列或電荷耦合器件 (CCD)。單光電二極體檢測器和光電倍增管與掃描單色儀一起使用，單色儀過濾光線，以便一次只允許單一波長的光到達檢測器。掃描單色儀移動衍射光柵以“逐步”透過每個波長，以便可以測量其強度與波長的關係。固定單色儀與 CCD 和光電二極體陣列一起使用。由於這兩種裝置都包含多個檢測器，這些檢測器分組為一維或二維陣列，因此它們能夠同時收集不同波長的光，這些光落在不同的畫素或畫素組上。
裝置主要分為兩類：單光束和雙光束。雙光束分光光度計比較兩條光路徑之間的光強度，一條路徑包含參考樣品，另一條路徑包含測試樣品。單光束分光光度計測量插入測試樣品前後光束的相對光強度。
用於 UV/Vis 分光光度計的樣品通常是液體，儘管氣體甚至固體的吸光度也可以測量。樣品通常放置在一個透明的容器中，稱為比色皿。比色皿通常呈矩形，通常內寬為 1 cm。（此寬度在比爾-朗伯定律中成為光程 d。）所用樣品容器型別必須允許輻射透過感興趣的光譜區域。最廣泛適用的比色皿由高質量熔融石英或石英玻璃製成，因為它們在紫外、可見和近紅外區域內都是透明的。玻璃和塑膠比色皿也很常見，儘管玻璃和大多數塑膠在紫外線下會吸收，這限制了它們在可見光波長下的使用。
以下工具可用於計算蛋白質的摩爾衰減係數
**圓二色性 (CD)** 是涉及圓偏振光的二色性，即左手和右手圓偏振光的差異吸收。左手圓偏振 (LHC) 和右手圓偏振 (RHC) 光代表光子的兩種可能的自旋角動量狀態。這種現象存在於旋光活性手性分子的吸收帶中。CD 光譜法具有廣泛的應用範圍。最值得注意的是，UV CD 用於研究蛋白質的二級結構。
CD 與 **旋光色散 (ORD)** 技術密切相關，通常被認為更先進。CD是在感興趣分子的吸收帶內或附近測量的，而 ORD可以在遠離這些帶的地方測量。CD 的優勢在資料分析中很明顯。結構元素更容易區分，因為它們記錄的譜帶在特定波長處沒有像 ORD 中那樣廣泛地重疊。原則上，如果測量中包含所有吸收，則可以透過積分變換將這兩種光譜測量值相互轉換。
電磁輻射由相互垂直且垂直於傳播方向的電場 (E) 和磁場 (B) 組成，即橫波。當電場向量僅在一個平面上振盪時，就會發生線偏振光，而當電場向量的方向在其傳播方向上旋轉而向量保持恆定大小時，就會發生圓偏振光。在空間中的一個點，圓偏振向量將在波頻率的一個週期內畫出一個圓，因此得名。下面的兩個圖表顯示了線偏振光和圓偏振光的電向量，在時間上的一個時刻，用於一系列位置；圓偏振電向量的圖繪製了沿傳播方向 (k) 的螺旋線。對於向觀察者傳播的左旋圓偏振光 (LCP)，電向量逆時針旋轉。對於右旋圓偏振光 (RCP)，電向量順時針旋轉。
當圓偏振光穿過吸收旋光活性介質時，右偏振光和左偏振光之間的速度不同，它們的波長也不同，它們被吸收的程度也不同（εL≠εR）。**圓二色性** 是差異 Δε ≡ εL- εR。
簡而言之，由於圓偏振光本身是“手性的”，因此它與手性分子以不同的方式相互作用。也就是說，兩種圓偏振光的吸收程度不同。在 CD 實驗中，相同量的左旋和右旋圓偏振光以選定的波長交替照射到（手性）樣品中。兩種偏振光中的一種比另一種吸收更多，並測量這種與波長相關的吸收差異，從而得到樣品的 CD 光譜。由於與分子的相互作用，光的電場向量在穿過樣品後會沿著橢圓路徑旋轉。
重要的是，分子的手性可能是構象性的，而不是結構性的。也就是說，例如，具有螺旋二級結構的蛋白質分子可以具有隨構象變化而變化的 CD。
根據定義，
其中 ΔA 是左旋圓偏振光 (LCP) 和右旋圓偏振光 (RCP) 吸光度的差（通常測量的是這個）。ΔA 是波長的函式，因此對於有意義的測量，必須知道進行測量的波長。
摩爾圓二色性定義為
其中 εL 和 εR 是 LCP 和 RCP 光的摩爾消光係數。
雖然通常測量 ΔA，但出於歷史原因，大多數測量結果以**橢圓度**度數報告。摩爾橢圓度是針對濃度校正的圓二色性。摩爾圓二色性和摩爾橢圓度 [θ] 透過以下方程式輕鬆相互轉換
在圓二色性 (CD) 的許多實際應用中，測量的 CD 不僅僅是分子的內在特性，而是取決於分子構象。在這種情況下，CD 也可能是溫度、濃度和化學環境（包括溶劑）的函式。在這種情況下，報告的 CD 值還必須指定這些其他相關因素，以便具有意義。
蛋白質的遠紫外 (UV) 圓二色光譜可以揭示其二級結構的重要特徵。圓二色光譜可以很容易地用於估計分子中處於α-螺旋構象、β-摺疊構象、β-轉角構象或其他（例如無規捲曲）構象的比例。這些比例分配對蛋白質可能存在的二級構象施加了重要限制。一般來說，圓二色光譜不能確定檢測到的α-螺旋在分子中的位置，甚至不能完全預測α-螺旋的數量。儘管如此，圓二色光譜仍然是一個很有價值的工具，尤其是在顯示構象變化方面。例如，它可以用來研究分子的二級結構如何隨著溫度或變性劑濃度（例如鹽酸胍或尿素）的變化而變化。透過這種方式，它可以揭示關於該分子的重要熱力學資訊（例如變性焓和吉布斯自由能），這些資訊無法透過其他方法輕易獲得。任何試圖研究蛋白質的人都將發現圓二色光譜是一個寶貴的工具，因為它可以在進行廣泛和/或昂貴的實驗之前驗證蛋白質是否處於其天然構象。此外，圓二色光譜在蛋白質化學中還有許多其他用途，與α-螺旋比例估計無關。
蛋白質的近紫外圓二色光譜 (>250 nm) 提供了關於其三級結構的資訊。在 250–300 nm 區域獲得的訊號是由於苯丙氨酸、酪氨酸、半胱氨酸（或 S-S 二硫鍵）和色氨酸氨基酸的吸收、偶極取向及其周圍環境的性質。與遠紫外圓二色光譜不同，近紫外圓二色光譜不能分配給任何特定的 3D 結構。相反，近紫外圓二色光譜提供了關於蛋白質中輔基性質的結構資訊，例如血紅蛋白和細胞色素 c 中的血紅素基團。
可見光圓二色光譜是一種非常強大的技術，可以用來研究金屬-蛋白質相互作用，並且可以將各個 d-d 電子躍遷解析為單獨的譜帶。只有當金屬離子處於手性環境中時才會在可見光區域產生圓二色光譜，因此，溶液中的遊離金屬離子不會被檢測到。這具有僅觀察蛋白質結合金屬的優點，因此可以輕鬆獲得 pH 依賴性和化學計量關係。
與 X 射線晶體學和蛋白質核磁共振波譜等技術相比，圓二色光譜提供了較少的資訊。X 射線晶體學和蛋白質核磁共振波譜都能提供原子解析度的資料。然而，圓二色光譜是一種快速的方法，不需要大量的蛋白質或繁瑣的資料處理。因此，圓二色光譜可以用於研究大量的溶劑條件，包括溫度、pH 值、鹽度以及各種輔因子的存在。
圓二色光譜通常用於研究溶液中的蛋白質，因此它補充了研究固態蛋白質的方法。這也是一個限制，因為許多蛋白質在其天然狀態下嵌入膜中，並且含有膜結構的溶液通常會強烈散射光。
圓二色光譜的測量受到一個事實的複雜化，即典型的含水緩衝系統通常會在結構特徵表現出對圓偏振光差吸收的範圍內發生吸收。磷酸鹽、硫酸鹽、碳酸鹽和醋酸鹽緩衝液通常與圓二色光譜不相容，除非將其稀釋到極低的濃度，例如 10–50 mM 範圍。在進行遠紫外圓二色光譜時，應完全避免使用 Tris 緩衝系統。硼酸鹽和翁類化合物通常用於建立圓二色光譜實驗的適當 pH 範圍。一些實驗人員用氟化物代替氯離子，因為氟化物在遠紫外區的吸收較少，而一些實驗人員則在純水中進行實驗。另一種幾乎通用的技術是，在遠紫外區進行實驗時，使用較短光程的比色皿來最小化溶劑吸收，在本工作中，0.1 mm 光程並不罕見。
除了在含水系統中進行測量外，圓二色光譜，特別是遠紫外圓二色光譜，可以在有機溶劑中進行測量，例如乙醇、甲醇或三氟乙醇 (TFE)。後者具有誘導蛋白質結構形成的優勢，在一些蛋白質中誘導 β-摺疊，在另一些蛋白質中誘導 α-螺旋，而這些蛋白質在正常的水性條件下不會顯示出這些結構。然而，大多數常見的有機溶劑，例如乙腈、THF、氯仿、二氯甲烷，與遠紫外圓二色光譜不相容。
值得注意的是，用於二級結構估計的蛋白質圓二色光譜與連線氨基酸的醯胺鍵的 π 到 π* 軌道吸收有關。這些吸收帶部分位於所謂的真空紫外區（波長小於約 200 nm）。由於氧氣在這些波長處對光的強烈吸收，因此實際感興趣的波長區域在空氣中是無法獲得的。實際上，這些光譜不是在真空中測量的，而是在一個無氧儀器（充滿純氮氣）中測量的。