載體

在分子克隆中，載體是指一種 DNA 分子，用作載體，人工將外源遺傳物質帶入另一個細胞，在那裡它可以被複制和/或表達。含有外源 DNA 的載體被稱為重組 DNA。四種主要型別的載體是質粒、病毒載體、柯斯質粒和人工染色體。其中，最常用的載體是質粒。

載體本身通常是一個 DNA 序列，包含一個插入片段（轉基因）和一個更大的序列，作為載體的“骨架”。將遺傳資訊轉移到另一個細胞的載體的目的是通常是將插入片段分離、複製或表達在目標細胞中。

克隆載體用於擴增 DNA 片段。克隆載體的基本特徵是複製起點、篩選標記（通常是抗生素抗性）和多克隆位點（MCS 或多連線位點）。多克隆位點是一個包含多個常用限制酶位點的短區域，允許在該位置輕鬆插入 DNA 片段。除此之外，一些克隆載體還帶有其他特徵，如報告基因，有助於篩選成功克隆。最突出的例子是 lacZα 基因，它可以用於 α-互補的藍白篩選。

表達載體用於生產蛋白質。為此，它們必須攜帶一些額外的特徵，最重要的是啟動子、核糖體結合位點和終止子。

質粒

質粒是存在於幾乎所有型別細菌中的染色體外 DNA 分子。最常見的是，它們是雙鏈 DNA 的環狀分子，雖然也存線上性質粒。它們的大小可以從幾千到幾十萬個鹼基對不等。在自然界中，質粒攜帶可能有利於生物體生存的基因（例如抗生素抗性），但是它們通常在正常條件下對細菌生長不是必需的。通常，質粒可以透過水平基因轉移從一個細菌傳遞到另一個細菌（即使是不同物種）。人工質粒廣泛用作分子克隆中的載體，用於在宿主生物體內驅動重組 DNA 序列的複製。

複製

質粒是複製子，這意味著它們可以自主複製。但是，它們主要依靠宿主細胞的 DNA 複製機制來做到這一點。質粒中複製開始的區域稱為複製起點（縮寫為 ori 或 rep，有時也稱為 oriV 表示營養型複製起點，以區別於轉運複製所需的 oriT）。複製起點決定了複製機制，它有兩種基本變體。用於複製的蛋白質通常編碼在 ori 附近。除此之外，ori 也是決定質粒其他特性的關鍵因素，例如複製數、宿主範圍和不相容性組。

θ複製

最常見的複製機制被稱為 θ 複製。它從 ori 區域兩條鏈的分離開始，形成一個類似於希臘字母 θ（θ）的結構。複製從 RNA 引物開始，然後沿質粒單向或雙向進行。當複製叉再次到達 ori 時（單向）或兩個複製叉相遇時（雙向），DNA 分子分離。

質粒 ColE1 和許多從該質粒中獲得 ori 的克隆載體表現出這種機制。

滾環複製

滾環複製是另一種廣泛存在的複製機制。在這種情況下，複製包括兩個階段：首先，DNA 複製形成雙鏈和單鏈環狀 DNA。之後，在單鏈 DNA 上新增互補鏈，形成兩個雙鏈質粒。

滾環複製由質粒編碼的 Rep 蛋白啟動。它與質粒的雙鏈複製起點 (DSO) 結合，這可能使 DNA 形成十字形結構。然後，該蛋白切割其中一條鏈並在切口鏈的 5' 磷酸末端共價結合。釋放的遊離 3' 羥基末端作為 DNA 聚合酶 III 的 DNA 合成的引物。以未切割鏈為模板，複製沿質粒進行，將切割鏈置換為單鏈 DNA。一旦這個單鏈環完成，與 Rep 相連的 5' 末端和置換的 3' 末端在一個磷酸轉移反應中連線起來。當 DNA 聚合酶返回 DSO 時，雙鏈環也閉合。這可能涉及建立第二個切口和宿主 DNA 連線酶。

置換單鏈的複製從單鏈複製起點 (SSO) 開始，該起點僅在置換幾乎完成時才合成。在 SSO 處，RNA 聚合酶為 DNA 聚合酶 III 製造引物，DNA 聚合酶 III 合成互補鏈。一旦完成，DNA 聚合酶 I 替換 RNA 引物，DNA 連線酶連線末端。

複製數

每個細胞中特定質粒的數量是一個特徵，主要由複製起點決定。它可以從每個細胞一個到每個細胞幾百個相同質粒不等。天然質粒往往具有較低的複製數，但可以透過突變和消除控制機制大幅增加。控制複製數對質粒來說非常重要。一方面，它們必須跟上宿主細胞的複製。另一方面，它們不應該成為宿主過大的負擔。高複製數質粒只需要一種機制來應對後者，這意味著一旦達到一定的複製數，複製應該被抑制。這種質粒被稱為鬆弛型質粒。相反，嚴格型質粒具有較低的複製數，因此需要更嚴格的控制機制。

ColE1 複製起始點的複製控制

帶有 ColE1 複製起始點的質粒的複製數受兩種 RNA 轉錄本，RNA II 和 RNA I 的調控。RNA II 對於複製起始是必需的，而 RNA I 則作為其抑制劑。

新生的 RNA II，其轉錄起始於複製起始點上游 555 bp，與複製起始點附近的模板 DNA 形成雜交體。RNase H 切割 RNA 鏈並暴露 3' 羥基。然後，加工後的 RNA II 可以作為 DNA 聚合酶 I 進行 DNA 合成的引物。

引物形成受到 RNA I 的抑制，RNA I 是一種較短的轉錄本，與 RNA II 的 5` 末端互補。當存在 RNA I 時，它與 RNA II 形成雜交體。這改變了 RNA II 的摺疊，使得 DNA-RNA 雜交體不穩定，切割不會發生。因此，RNA I 的降解速率是控制質粒複製的主要因素。這種降解速率在 pcnB（質粒複製數 B）基因產物的幫助下加速，該產物在 RNA I 的 3' 末端新增聚腺苷酸，使其成為 PNPase 降解的目標。

rop 蛋白增強了 RNA I 與 RNA II 的結合。因此，刪除相應基因會增加質粒複製數。

宿主範圍

質粒可以複製的細菌型別稱為其宿主範圍。它通常由複製起始點決定。帶有 ColE1 複製起始點的質粒宿主範圍狹窄，它們只能在大腸桿菌和一些密切相關的物種中複製。與此相反，廣宿主範圍質粒可以在許多僅遠緣相關的細菌中複製。這些質粒編碼複製起始所需的所有蛋白質，因此在這方面獨立於宿主細胞。此外，它們的啟動子和核糖體結合位點在許多細菌中被識別。

確定質粒的宿主範圍可能具有挑戰性，尤其是在轉化和篩選方面。因此，大多數質粒的實際宿主範圍是未知的。

不相容性

當兩個質粒不能穩定地共存於同一個細胞中時，它們是不相容的。這適用於具有相同複製起始點的質粒，因為它們爭奪複製因子。如果一個複製速度更快（例如，因為它更小）或具有不同的生長優勢，它將在多個世代中超過另一個。在細胞分裂過程中，兩個質粒的不均勻分佈也會導致其中一個被消除。

透過分析當兩個特定質粒存在於同一個細胞中時，消除機率是否增加，可以將質粒分配到不相容性 (Inc) 類群中。雖然同一 Inc 類群的成員不能長期共存，但來自不同類群的質粒可以穩定共存，並且不會比在不存在另一個質粒的情況下更容易被消除。

分配和質粒維持

質粒對宿主細胞來說是一種代謝負擔。因此，無質粒細胞通常具有生長優勢，並且從長遠來看，將取代含有質粒的細胞。為了避免這種情況，已經進化出不同的機制來提高質粒的分離穩定性，即質粒從一個世代細胞傳到另一個世代細胞的可能性。不要與結構穩定性混淆，結構穩定性指的是核苷酸序列的儲存。

隨機分配

在最簡單的情況下，質粒被隨機傳到子細胞。複製數越高，兩個細胞都繼承質粒的可能性越大。然而，當複製數較低時，無質粒細胞可能會發育並超過其他細胞，除非其他機制阻止這種情況發生。

主動分配

確保兩個細胞在細胞分裂過程中都收到質粒複製的一個有效方法是分配系統。這種系統可以在每個細胞中只存在一個或很少幾個複製的質粒上找到。它們的複製以類似於染色體的方式控制，這意味著質粒在每次染色體複製啟動時都會複製。最容易理解的例子是大腸桿菌 R1 質粒的 Par 系統。

該系統由 ParR 和 ParM 蛋白以及質粒上的parC位點組成。複製後，ParR 與質粒的parC位點相互作用，形成一個分配複合體。ParM-ATP 結合該複合體並形成一個細絲，將質粒推向兩極。ATP 被水解，ParM-ADP 解聚，使質粒位於相對的兩極。

選擇性優勢

許多質粒至少攜帶一個基因，為宿主提供選擇性優勢。最常見的是抗生素抗性。另一種可能性是質粒包含一個重要的基因，該基因在宿主的染色體中發生突變或缺失。在相應的選擇壓力下，細胞會保留這些質粒，因為被消除的細胞生長緩慢或死亡。

成癮系統

一些質粒包括一個系統，如果細胞在細胞分裂過程中沒有繼承質粒，就會殺死細胞。這些毒素-抗毒素系統由兩個或多個緊密連線的基因組成，這兩個基因既編碼“毒藥”，也編碼相應的“解毒劑”。如果質粒在細胞分裂後不存在，不穩定的抗毒素會被降解，穩定的毒蛋白會殺死新細胞。這被稱為分裂後殺傷 (PSK)。

一些毒素-抗毒素系統依賴於互補抗毒素 RNA 與毒素 mRNA 的鹼基配對。然後透過 RNase III 降解或透過遮蔽 Shine-Dalgarno 序列或核糖體結合位點來抑制 mRNA 的翻譯。通常，毒素和抗毒素編碼在 DNA 的相反鏈上。

在其他系統中，不穩定的蛋白質抗毒素緊密結合並抑制穩定的毒素的活性。一個例子是大腸桿菌 F 質粒中發現的 CcdA/CcdB 系統。CcdB 靶向 DNA 旋轉酶並抑制染色體 DNA 的分配。只要細胞包含 F 質粒，CcdB 就被 CcdA 結合並中和。失去質粒後，CcdA 衰變，CcdB 的活性殺死細胞。

在生物技術中，毒素-抗毒素系統可用於維持細菌培養物中的質粒。此外，它們可用於分子克隆，以正向篩選已吸收包含插入片段的質粒的細胞。這種應用的一個例子來自ccdB基因，該基因已被整合到質粒載體中。然後將目的基因靶向重組到ccdB基因座中，使毒蛋白的轉錄失活。因此，含有質粒但不含插入片段的細胞因 CcdB 蛋白的毒性作用而死亡，只有那些整合了插入片段的細胞才能存活。

多聚體質粒的分辨

質粒可以形成二聚體或更高聚體，這會降低有效複製數，從而增加細胞在細胞分裂過程中沒有收到質粒的風險。二聚體可能是兩個單體的重組結果。隨後的重組可以形成更高的聚體。為了避免聚體的積累，許多質粒具有位點特異性重組系統，可以解析聚體。這些系統由可能由宿主或質粒編碼的蛋白質以及質粒上的特定位點組成。在二聚體或聚體中，重組位點出現多次。然後該系統促進這些位點之間的重組，將聚體旋轉成單體質粒。

一個眾所周知的例子是 ColE1 使用的cer-XerCD 系統。cer是質粒上的重組位點，而 XerC 和 XerD 是大腸桿菌位點特異性重組系統的一部分。只有當兩個其他宿主蛋白 PepA 和 ArgR 結合在它附近時，cer位點才會被識別。如果是這種情況，XerCD 重組酶可以促進兩個cer位點之間的重組。

構象

質粒DNA可能以五種構象之一齣現，這五種構象在電泳過程中以不同的速度在凝膠中執行（對於給定大小）。以下列出這些構象，按電泳遷移率（給定電壓下速度）從最慢到最快排列

切開的開環DNA 有一條鏈斷裂。
鬆弛環狀DNA 完整無缺，兩條鏈都未斷裂，但已透過酶促方式鬆弛（超螺旋被去除）。
線性DNA 具有遊離末端，要麼是因為兩條鏈都被切斷，要麼是因為DNA在體內是線性的。
超螺旋（或共價閉合環狀）DNA 完整無缺，兩條鏈都未斷裂，並且具有一個完整的扭轉，形成緊湊的結構。
超螺旋變性DNA 與超螺旋DNA類似，但具有未配對的區域，使其略微不太緊湊；這可能是由於質粒製備過程中鹼性過強造成的。

分子生物學中的質粒

質粒是遺傳工程中最常見的載體。它們是遺傳學和生物技術實驗室的重要工具，在這些實驗室中，它們通常用於複製或表達特定的基因。許多質粒可用於此類用途。

高複製數質粒適合作為克隆載體。另一方面，表達載體可以是低複製數質粒，因為重點是生產蛋白質而不是DNA。

pBR322 和 pUC19 是常見的克隆載體的例子。pBR322 是在 1977 年建立的，是第一個廣泛使用的大腸桿菌克隆載體之一。它以建造它的墨西哥博士後研究人員的名字命名。p 代表“質粒”，BR 代表“Bolivar”和“Rodriguez”。pBR322 長 4361 個鹼基對，包含 pMB1 的 ori，pMB1 是 ColE1 的近親。它編碼兩種蛋白質，使大腸桿菌對氨苄青黴素和四環素產生抗性，並且具有超過 40 種限制性內切酶的獨特限制性位點。

pUC19 是最廣泛使用的質粒載體之一。它包含一個氨苄青黴素抗性基因（ampR）和lacZα片段，用於藍白篩選。ori 位點來自 pMB1。pUC 體積小，但複製數高，這是由於缺乏rop基因和 pMB1 的 ori 中的一個點突變導致的。pUC18 是另一個流行的克隆載體，它與 pUC19 的區別僅在於 MCS 的方向。

噬菌體

噬菌體或噬菌粒是一種質粒，它包含來自 f1 噬菌體的 f1 複製起點。許多常用的質粒包含 f1 ori，因此是噬菌體。f1 ori 使單鏈複製和包裝成噬菌體顆粒成為可能。然而，噬菌體也包含一個雙鏈複製的複製起點，這意味著它們可以作為質粒複製。

與質粒類似，噬菌體可用於克隆 DNA 片段並將其匯入細菌宿主。然而，用“輔助”噬菌體（例如 VCSM13 或 M13K07）感染含有噬菌體的細菌宿主，可提供必要的病毒成分，從而實現單鏈 DNA 複製和將噬菌體 DNA 包裝成噬菌體顆粒。絲狀噬菌體抑制細菌生長，但與 λ 噬菌體和 T7 噬菌體相比，通常不是裂解性的。輔助噬菌體通常經過工程改造，其包裝效率低於噬菌體（透過有缺陷的噬菌體 ori），因此產生的噬菌體顆粒主要含有噬菌體 DNA。F1 絲狀噬菌體感染需要存在菌毛，因此只有含有 F 質粒或其衍生物的細菌宿主才能用於生成噬菌體顆粒。

在迴圈測序技術開發之前，噬菌體用於生成用於測序的單鏈 DNA 模板。如今，噬菌體仍然對生成用於定點誘變的模板很有用。對絲狀噬菌體生命週期和結構特徵的詳細表徵導致了噬菌體展示技術的開發，在這種技術中，可以將一系列肽和蛋白質表達為噬菌體衣殼蛋白的融合體，並在病毒表面展示。展示的肽和多肽與噬菌體顆粒中相應的編碼 DNA 相關聯，因此該技術適用於研究蛋白質-蛋白質相互作用和其他配體/受體組合。

宇宙

宇宙是一種混合質粒，包含一個 λ 噬菌體cos 序列（cos 位點 + 質粒 = 宇宙）。如果宇宙具有合適的複製起點，它們可以作為質粒複製：例如，哺乳動物細胞中的 SV40 ori，原核生物中的 ColE1 ori 用於雙鏈 DNA 複製，或 f1 ori 用於單鏈 DNA 複製。與質粒不同，它們也可以包裝在噬菌體衣殼中，這使得外源基因可以透過轉導轉移到細胞中或細胞之間。

當一定量的 DNA 被插入質粒後，質粒會變得不穩定，因為它們增大的尺寸更有利於重組。為了避免這種情況，使用噬菌體轉導。這是由粘性末端（也稱為cos位點）實現的。這樣，它們類似於使用 λ 噬菌體作為載體，不同之處在於，除了cos序列之外，所有 λ 基因都被刪除了。宇宙可以包含 37 到 52（通常為 45）kb 的 DNA，限制基於正常的噬菌體包裝大小。宇宙可用於構建基因組文庫。

細菌人工染色體

細菌人工染色體 (BAC) 基於功能性育性質粒（或 F 質粒），用於細菌中的轉化和克隆。F 質粒起著至關重要的作用，因為它們包含分割槽基因，這些基因促進了細菌細胞分裂後質粒的均勻分佈。細菌人工染色體通常的插入大小為 150-350 kb。從細菌 P1 質粒中也產生了類似的克隆載體，稱為 PAC。

BAC 在人類基因組計劃等基因組計劃中經常使用。在此過程中，生物體 DNA 的一小段作為 BAC 中的插入物進行擴增，然後測序。最後，測序的片段在計算機中重新排列，從而得到生物體的基因組序列。BAC 被更快速、更省力的測序方法（如全基因組鳥槍法測序）所取代，最近則是下一代測序。

酵母人工染色體

酵母人工染色體 (YAC) 是從釀酒酵母的 DNA 中衍生出的基因工程染色體，然後將其連線到細菌質粒中。透過插入 100-1000 kb 的大片段 DNA，可以克隆插入的序列，並使用染色體行走進行物理作圖。這是最初用於人類基因組計劃的過程，但由於穩定性問題，YAC 被細菌人工染色體的使用所取代。從 Rankin 等人的初步研究開始，Strul 等人和 Hsaio 等人，透過發現必要的自主複製序列 (ARS) 穩定了固有的脆弱染色體；Murray 等人在 1983 年描述了一種利用這些資料的精煉 YAC。YAC 的主要組成部分是來自釀酒酵母的 ARS、著絲粒和端粒。此外，使用可選擇的標記基因，例如抗生素抗性和可見標記，來選擇轉化的酵母細胞。如果沒有這些序列，染色體在細胞外複製過程中將不穩定，並且將無法與沒有載體的菌落區分開來。

酵母表達載體，例如 YAC、YIp（酵母整合質粒）和YEp（酵母遊離質粒），比細菌人工染色體具有優勢，因為它們可以用於表達需要翻譯後修飾的真核蛋白。由於能夠插入大的 DNA 片段，因此 YAC 可用於克隆和組裝生物體的整個基因組。將 YAC 插入酵母細胞後，它們可以作為線性人工染色體進行繁殖，在此過程中克隆插入的 DNA 區域。

細菌載體的共同特徵

抗生素抗性

氨苄青黴素

氨苄青黴素屬於青黴素類β-內醯胺類抗生素，能夠穿透革蘭氏陽性菌和一些革蘭氏陰性菌。它與青黴素G或苄青黴素的區別僅在於存在一個氨基。該氨基幫助藥物穿透革蘭氏陰性菌的外膜。

氨苄青黴素作為一種不可逆的轉肽酶抑制劑，而轉肽酶是細菌合成細胞壁所需的。它抑制細菌細胞壁合成的第三階段和最後階段，即二元分裂，最終導致細胞裂解。氨苄青黴素具有殺菌作用。

對氨苄青黴素的耐藥性是由amp或bla基因賦予的，該基因編碼一種β-內醯胺酶。β-內醯胺酶透過破壞抗生素的結構來提供對β-內醯胺類抗生素的耐藥性。

在大腸桿菌中，β-內醯胺酶分泌到周質空間，並可釋放到培養基中，在那裡它會迅速降解氨苄青黴素。在平板上，當氨苄青黴素濃度過低時，會形成衛星菌落。

卡那黴素

卡那黴素是一種氨基糖苷類殺菌抗生素，它與原核生物核糖體的30S亞基相互作用。它誘導大量錯誤翻譯，並在蛋白質合成過程中間接抑制轉運。

對卡那黴素的耐藥性是由來自轉座子Tn5的npt II基因（也稱為kan或neo）賦予的，該基因編碼新黴素磷酸轉移酶。

鏈黴素

鏈黴素是第一個被發現的氨基糖苷類抗生素，也是第一個治療結核病的藥物。鏈黴素抑制革蘭氏陽性菌和革蘭氏陰性菌的蛋白質合成。它結合到細菌核糖體30S亞基的小16S rRNA上，干擾甲醯甲硫氨醯-tRNA與30S亞基的結合。這導致密碼子錯誤解讀，最終抑制蛋白質合成，並最終導致微生物細胞死亡。

氯黴素

氯黴素是一種對多種革蘭氏陽性菌和革蘭氏陰性菌（包括大多數厭氧生物）有效的抑菌抗生素。它透過抑制細菌核糖體的肽醯轉移酶活性來阻止蛋白質鏈延伸。

cat 基因賦予對氯黴素的耐藥性。該基因編碼一種名為氯黴素乙醯轉移酶的酶，該酶透過將一個或兩個乙醯基（來自乙醯基-S-輔酶A）共價連線到氯黴素分子上的羥基上，使氯黴素失活。乙醯化阻止了氯黴素與核糖體結合。

四環素

四環素是一種抑菌抗生素，它透過阻止帶電氨醯基-tRNA與核糖體上的A位點結合來抑制蛋白質合成。四環素結合到微生物核糖體的30S亞基上。因此，它阻止了新的氨基酸引入新生肽鏈。該作用通常是抑制作用，並在撤回藥物後可逆。儘管四環素結合到原核生物和真核生物的小核糖體亞基（分別為30S和40S），但哺乳動物細胞對四環素的影響不太敏感。這是因為細菌積極地將四環素泵入它們的細胞質，而哺乳動物細胞則不這樣做。

分子生物學中使用了幾種耐藥基因，最常見的是tetA、tetB和tetC，它們編碼一個外排系統，即一種與膜相關的蛋白，它主動地將四環素從細胞中排出。這些基因受阻遏蛋白（TetR）的調控。這一特性已被用於控制基因表達（Tet-On和Tet-Off）。

lacZ

β-半乳糖苷酶是由lac操縱子的lacZ 基因編碼的蛋白質，它以四聚體形式存在於其活性狀態。然而，源自大腸桿菌M15菌株的突變β-半乳糖苷酶的N端殘基11-41被刪除，這種突變體，即ω-肽，不能形成四聚體，並且是無活性的。然而，這種突變體可以在存在蛋白質的N端片段，即α-肽的情況下，完全恢復到其活性的四聚體狀態。突變β-半乳糖苷酶的α-肽挽救功能被稱為α-互補。

在這種篩選方法中，宿主大腸桿菌菌株攜帶lacZ缺失突變體（lacZΔM15}，其中包含ω-肽，而使用的質粒攜帶lacZα序列，該序列編碼β-半乳糖苷酶的前59個殘基（α-肽）。兩者本身都不是功能性的。然而，當兩種肽一起表達時，例如當含有lacZα序列的質粒轉化到lacZΔM15細胞中時，它們會形成功能性的β-半乳糖苷酶。

藍白篩選方法透過破壞這種α-互補過程來起作用。質粒在lacZα序列內有一個內部多克隆位點。將插入片段整合到MCS中會破壞基因，因此不會產生功能性的α-肽。因此，在含有帶有插入片段的質粒的細胞中，不會形成功能性的β-半乳糖苷酶。

可以透過X-gal檢測到活性β-半乳糖苷酶的存在，X-gal是一種無色的乳糖類似物，可以被β-半乳糖苷酶裂解形成明亮的藍色不溶性色素。這導致含有功能性β-半乳糖苷酶的細胞呈現出特徵性的藍色。因此，藍色菌落表明它們可能含有具有完整lacZα的載體（因此沒有插入片段），而白色菌落（X-gal不被水解）表明lacZα中存在插入片段，破壞了活性β-半乳糖苷酶的形成。

哺乳動物載體的常見特徵

啟動子

CMV

立即早期鉅細胞病毒啟動子可用於在多種哺乳動物細胞系中進行高水平表達。

SV40

SV40（猿猴病毒40）啟動子包含SV40增強子啟動子區域和複製起點，用於在表達大T抗原的細胞系中進行高水平表達和複製。它包含兩個72 bp SV40增強子重複序列。

EF-1α

EF-1α 啟動子是一個強效的、組成型的、非病毒啟動子。EF-1α 基因編碼延伸因子-1α，它催化氨醯-tRNA 與核糖體的 GTP 依賴性結合。EF-1α 是真核細胞中最豐富的蛋白質之一，幾乎在所有哺乳動物細胞中表達。

UbC

UbC（人泛素C）啟動子在廣泛的物種和組織型別中提供高水平的表達。在 HEK293 細胞中，它通常具有 CMV 和 EF-1α 啟動子約 50% 的活性。

PGK

PGK（鼠磷酸甘油酸激酶-1）啟動子是一個普遍存在的管家基因啟動子，它促進長期持續表達。

Kozak 序列

Kozak 共識序列是真核 mRNA 上出現的一個序列，它在翻譯起始過程中起著重要作用。它的共識序列為(gcc)gccRccAUGG. 小寫字母表示該位置最常見的鹼基，儘管鹼基可能有所不同，但大寫字母表示高度保守的鹼基。括號中的序列意義不明確。AUG 核苷酸是起始密碼子，編碼蛋白質 N 端的甲硫氨酸氨基酸。

核糖體需要這個序列，或可能的變體來啟動翻譯。變體可能會影響從 mRNA 合成的蛋白質數量。

Kozak 序列不要與核糖體結合位點 (RBS) 混淆。

可選擇標記

G418

G418（遺傳黴素）是一種氨基糖苷類抗生素，透過抑制原核和真核細胞中延伸步驟來阻止多肽合成。對 G418 的抗性是由 Tn5 中的 neo 基因賦予的，該基因編碼氨基糖苷 3'-磷酸轉移酶 APT 3' II。G418 通常用於實驗室研究，以選擇基因工程細胞（通常使用 KanMX 可選擇標記）。一般來說，對於細菌和藻類，使用 5 mg/L 或更低的濃度，對於哺乳動物細胞，選擇使用約 400 mg/L 的濃度，維持使用 200 mg/L 的濃度。然而，哺乳動物細胞中抗性克隆選擇的最佳濃度取決於所使用的細胞系以及攜帶抗性基因的質粒，因此應進行抗生素滴定以找到每個實驗系統的最佳條件。

殺稻瘟菌素 S

殺稻瘟菌素 S 阻止真核和原核細胞的生長。它透過抑制翻譯的終止步驟（以及在較小程度上抑制核糖體形成的肽鍵）發揮作用。最常見的抗性基因是 bsr 和 bsd，它們都編碼脫氨酶。

潮黴素 B

潮黴素 B 是一種由細菌 鏈黴菌 hygroscopicus 產生的抗生素。它是一種氨基糖苷類，透過抑制蛋白質合成殺死細菌、真菌和高等真核細胞。它穩定 tRNA-核糖體受體位點，從而抑制轉運。抗性基因（hyg 或 hph）是一種激酶，透過磷酸化使潮黴素 B 失活。

嘌呤黴素

嘌呤黴素是一種氨基核苷類抗生素，衍生自 鏈黴菌 alboniger 細菌，它在核糖體發生的翻譯過程中引起過早的鏈終止。該分子的一部分類似於氨醯化 tRNA 的 3' 端。它進入 A 位點並轉移到生長的鏈上，導致形成嘌呤黴醯化的新生鏈和過早的鏈釋放。

對嘌呤黴素的抗性是由 pac 基因賦予的，該基因編碼一種嘌呤黴素 N-乙醯轉移酶 (PAC)，該酶是在 鏈黴菌 生產菌株中發現的。嘌呤黴素在水中的溶解度為 50 mg/ml，在 10 mg/ml 時為無色溶液。在 -20 °C 下儲存時，嘌呤黴素溶液可穩定一年。作為細胞培養中選擇劑的推薦劑量範圍為 1-10 μg/ml，儘管在低至 1 μg/ml 的濃度下它可能對真核細胞有毒。嘌呤黴素作用迅速，可在 2 天內殺死多達 99% 的非抗性細胞。

殺稻瘟菌素

殺稻瘟菌素是一種糖肽類抗生素，是來自 鏈黴菌 verticillus 的弗萊黴素之一，屬於博來黴素類抗生素家族。它是一種廣譜抗生素，對大多數細菌、絲狀真菌、酵母菌、植物和動物細胞有效。它透過插入 DNA 引起細胞死亡，並誘導 DNA 的雙鏈斷裂。

對殺稻瘟菌素的抗性是由首先從 鏈黴菌 hindustanus 中分離出的 Sh ble 基因的產物賦予的。Sh ble 基因產物以一對一的比率結合抗生素，因此它不再能引起 DNA 的裂解。

有用連結

Addgene 是一個非營利性的全球質粒庫。Addgene 透過儲存質粒及其相關的克隆資料來促進實驗室之間遺傳物質的交換。

The PlasMapper 伺服器僅使用質粒 DNA 序列作為輸入，自動生成和註釋質粒圖。

SnapGene Viewer 可用於檢視和建立富含註釋的質粒圖。

參考文獻

Dale, J., Park, S.F., 2004. 細菌的分子遺傳學，第 4 版。Wiley，奇切斯特。
Snyder, L., 2013. 細菌的分子遺傳學，第 4 版。ASM 出版社，華盛頓特區。