DNA 分子克隆/PAGE 檢測
簡單來說，電泳是一種根據分子大小和電荷對分子進行分類的程式。使用電場，可以使分子（如 DNA）透過由瓊脂製成的凝膠移動。待分離的分子被分配到凝膠材料中的一個孔中。將凝膠置於電泳槽中，然後連線到電源。當施加電流時，較大的分子在凝膠中移動得更慢，而較小的分子移動得更快。不同大小的分子在凝膠上形成不同的條帶。[需要引用] 本例中的“凝膠”是指用於包含然後分離目標分子的基質。在大多數情況下，凝膠是交聯聚合物，其組成和孔隙率根據要分析的目標的特定重量和組成來選擇。在分離蛋白質或小核酸（DNA、RNA 或寡核苷酸）時，凝膠通常由不同濃度的丙烯醯胺和交聯劑組成，產生不同大小的聚丙烯醯胺網狀結構。在分離較大的核酸（大於幾百個鹼基）時，首選基質是純化的瓊脂糖。在這兩種情況下，凝膠形成固體但多孔的基質。丙烯醯胺不同於聚丙烯醯胺，它是一種神經毒素，必須採取適當的安全預防措施進行處理，以避免中毒。瓊脂糖由長而無分支的未帶電荷碳水化合物鏈組成，沒有交聯，從而導致凝膠具有大孔，允許分離大分子和大分子複合物。[需要引用] “電泳”指的是用於使分子透過凝膠基質移動的電動勢 (EMF)。透過將分子置於凝膠孔中並施加電場，分子將以不同的速率透過基質移動，這在所有物種的電荷與質量比 (Z) 均勻的情況下主要由它們的質量決定，如果帶負電荷則朝陽極移動，如果帶正電荷則朝陰極移動。
在核酸的情況下，從負極到正極的遷移方向是由於其糖磷酸骨架自然攜帶的負電荷。雙鏈 DNA 片段自然表現為長棒，因此它們在凝膠中的遷移與其大小成正比，對於環狀片段，與其回轉半徑成正比。單鏈 DNA 或 RNA 往往會摺疊成具有複雜形狀的分子，並且根據其三級結構以複雜的方式透過凝膠遷移。因此，會使用破壞氫鍵的試劑（如氫氧化鈉或甲醯胺）使核酸變性，使其再次表現為長棒。大型 DNA 或 RNA 的凝膠電泳通常透過瓊脂糖凝膠電泳進行。請參閱“鏈終止法”頁面以瞭解聚丙烯醯胺 DNA 測序凝膠的示例。可以透過遷移率轉移親和力電泳進行核酸或片段的配體相互作用表徵。RNA 樣品的電泳可用於檢查基因組 DNA 汙染以及 RNA 降解。來自真核生物的 RNA 顯示出 28s 和 18s rRNA 的明顯條帶，其中 28s 條帶的強度大約是 18s 條帶的兩倍。降解的 RNA 具有不太清晰的條帶，具有塗抹的外觀，強度比小於 2:1。
在透過電泳分離之前，可以以多種方式製備待分離的 DNA。對於大型 DNA 分子，通常使用 DNA 限制性內切酶（或稱為限制性酶）將 DNA 切成更小的片段。在其他情況下，例如 PCR 擴增的樣本，透過各種方法在分析之前去除樣本中可能影響分子分離的酶。一旦 DNA 被正確製備，DNA 溶液的樣本被放置在凝膠的孔中，並在凝膠上施加一定電壓，持續特定時間。
使用特異性識別 DNA 的熒光染料（例如溴化乙錠）來視覺化不同長度的 DNA 片段。凝膠顯示出對應於不同分子量的不同 DNA 分子群體的條帶。片段大小通常以“核苷酸”、“鹼基對”或“kb”（對於數千個鹼基對）表示，具體取決於分離的是單鏈 DNA 還是雙鏈 DNA。片段大小測定通常透過與含有已知長度的線性 DNA 片段的市售 DNA 標記進行比較來完成。
最常用於 DNA 電泳的凝膠型別是瓊脂糖（用於相對較長的 DNA 分子）和聚丙烯醯胺（用於短 DNA 分子的高解析度，例如 DNA 測序）。凝膠傳統上以“板”的形式執行，如圖所示，但毛細管電泳已成為高通量 DNA 測序等應用的重要技術。用於評估 DNA 損傷的電泳技術包括鹼性凝膠電泳和脈衝場凝膠電泳。測量和分析大多使用專門的凝膠分析軟體進行。毛細管電泳結果通常以稱為電泳圖的軌跡檢視顯示。
溴化乙錠 (EtBr) 和其他染料對 DNA 的視覺化
[edit | edit source]用於使瓊脂糖凝膠電泳的 DNA 或 RNA 條帶可見的最常見染料是溴化乙錠，通常縮寫為 EtBr。當嵌入 DNA（或 RNA）中時，它會在紫外線下發出熒光。透過使 DNA 透過 EtBr 處理的凝膠並用紫外線觀察，任何含有約 20 ng 以上 DNA 的條帶都會變得清晰可見。EtBr 是一種已知的誘變劑，有更安全的替代品。即使是核酸短時間暴露於紫外線下也會對樣品造成重大損害。樣品的紫外線損傷會降低隨後樣品操作（如連線和克隆）的效率。如果 DNA 在瓊脂糖凝膠分離後要使用，最好透過使用藍色光激發源來避免暴露於紫外線下，例如 Bio-Rad 的 Xcitablue 紫外線到藍光轉換屏或 Clare Chemicals 的 Dark Reader。需要藍色激發染料，例如 SYBR Green 或 GelGreen 染料之一。藍光對於視覺化也更好，因為它比紫外線更安全（眼睛保護不是那麼關鍵的要求），並且可以透過透明塑膠和玻璃。這意味著即使激發光透過玻璃或塑膠凝膠平臺，染色也會更亮。SYBR Green I 是另一種由 Invitrogen 生產的 dsDNA 染料。它更貴，但靈敏度高 25 倍，可能比 EtBr 更安全，儘管沒有資料說明其對人類的誘變性或毒性。SYBR Safe 是 SYBR Green 的變體，已被證明其誘變性和毒性水平低到足以在根據美國聯邦法規被視為非危險廢物。它具有與 EtBr 相似的靈敏度水平，但與 SYBR Green 一樣，價格要貴得多。然而，在強制性安全處置危險廢物的國家，EtBr 處置成本很容易超過初始價格差異。由於 EtBr 染色的 DNA 在自然光線下不可見，因此科學家在將混合物新增到凝膠之前將 DNA 與帶負電荷的載入緩衝液混合。載入緩衝液很有用，因為它們在自然光線下可見（與 EtBr 染色的 DNA 的紫外線不同），並且它們與 DNA 共沉澱（意味著它們以與特定長度的 DNA 相同的速度移動）。二甲苯氰醇和溴酚藍是載入緩衝液中常見的染料；它們執行速度與分別為 5000 bp 和 300 bp 長度的 DNA 片段大致相同，但精確位置會隨著凝膠百分比而變化。其他不太常用的進度標記是甲酚紅和橙黃 G，它們分別在約 125 bp 和 50 bp 處執行。也可以透過將 DNA 轉移到硝酸纖維素膜上，然後暴露於雜交探針來實現視覺化。此過程稱為 Southern 印跡。
電泳緩衝液
[edit | edit source]瓊脂糖電泳使用多種緩衝液。最常見的是：Tris/醋酸/EDTA (TAE)、Tris/硼酸/EDTA (TBE) 和硼酸鋰 (LB)。TAE 的緩衝能力最低，但對較大的 DNA 具有最佳解析度。這意味著電壓較低，時間更長，但產品更好。LB 相對較新，對於大於 5 kbp 的片段無效；但是，由於其電導率低，可以使用更高的電壓（高達 35 V/cm），這意味著常規電泳的分析時間更短。在電導率極低的介質（1 mM 硼酸鋰）中，3% 瓊脂糖凝膠可以分辨低至 1 個鹼基對的尺寸差異。
如何分析凝膠
[edit | edit source]電泳完成後，將凝膠置於紫外燈下照射（通常放在一個光盒上，同時使用防護裝備來減少紫外線照射），以觀察 DNA 條帶。溴化乙錠在 DNA 存在的情況下會發出橙紅色熒光。也可以將 DNA 條帶從凝膠中切出，然後溶解以回收純化的 DNA。凝膠可以隨後用數碼相機或寶麗來相機拍照。儘管染色的核酸發出橙紅色熒光，但影像通常以黑白顯示（見圖）。
凝膠電泳研究經常利用基於軟體的影像分析工具，例如 ImageJ。
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