分子克隆/製備感受態細胞 (''E.Coli'')
根據不同克隆程式所需的轉化效率，感受態細胞透過兩種不同的方法制備。
將一個新鮮的 LB 瓊脂平板上培養的大腸桿菌 DH5-α 單菌落接種到 5 ml LB 培養基中，並在 37 C、200 rpm 振盪培養 16 小時。將 1 ml 這種過夜培養物接種到 35 ml LB 培養基中，並在 37 C、200 rpm 振盪培養，直到 OD600 達到 0.55。然後將培養物在冰上冷卻 15 分鐘，並在 4 C 的 HB 4 轉子中，使用 Sorvall 離心機以 1,500g 離心 15 分鐘，將細胞沉澱下來。完全排出上清液，並將沉澱物輕輕重懸於 10 ml 冰冷的緩衝液 R1（100 mM RbCl、50 mM MnCl2.4H20.、30 mM 醋酸鉀、10 mM CaCl2.2H20、15% 甘油）中，並在冰上孵育 20 分鐘。然後將細胞分配到預冷的微量離心管中，每管 100 µl，在液氮中快速冷凍，並在 -70 C 下儲存。透過這種方法制備的感受態細胞通常能產生 5 x 106 到 1 x 107 個菌落/µg pUC18 DNA 的轉化效率，並且可以在 -70 C 下穩定儲存 3 個月。它們被用於大多數涉及連線相容粘性末端的常規克隆實驗。
緩衝液 R1
100 mM RbCl,
50 mM MnCl2.4H20.,
30 mM 醋酸鉀,
10 mM CaCl2.2H20,
15% 甘油
超感受態細胞是根據此處描述的方法制備的。將一個新鮮的 LB 瓊脂平板上培養的大腸桿菌 DH5 α 單菌落接種到 5 ml LB 培養基中，並在 37 C、200 rpm 振盪培養 16 小時。將 1 ml 這種過夜培養物接種到 100 ml LB 培養基中，並在 18 C、200 rpm 振盪培養，直到 OD600 達到 0.6。將培養物在冰上冷卻，並在 4 C 以 1,500g 離心 15 分鐘，將細胞沉澱下來。然後將細胞重懸於 32 ml 冰冷的緩衝液 I（10 mM PIPES pH 6.7、15 mM CaCl2、250 mM KCl、55 mM MnCl2）中，並在冰上孵育 10 分鐘。重複離心，並將細胞重懸於 8 ml 冰冷的含有 7% DMSO 的緩衝液 I 中，分配到 100 µl 的等分試樣中，在液氮中快速冷凍，並在 -70 C 下儲存。透過這種方法制備的超感受態細胞能產生 1 x 108 個菌落/µg pUC18 DNA 的轉化效率，並且可以在 -70 C 下穩定儲存 3 個月。超感受態細胞被用於涉及連線平末端 DNA 片段的克隆實驗。
緩衝液 I
10 mM PIPES pH 6.7,
15 mM CaCl2,
250 mM KCl,
55 mM MnCl2
從 -70 C 冰箱中取出感受態細胞，並在冰上解凍。將連線的 DNA 樣品 (5 µl) 加入到感受態細胞中，輕輕混合。將細胞在冰上孵育 30 分鐘，然後在 42 C 下進行熱休克 90 秒。熱休克後，向細胞中加入 400 µl LB，並將試管在 37 C 下孵育 1 小時。然後將細胞接種到含有 100 µg/ml 氨苄青黴素的 90 mm LB 瓊脂平板上。在質粒載體顯示出 α 互補特性的情況下，將細胞接種到含有適當抗生素的 LB 瓊脂平板上，並塗覆 40 µl 的 20 mg/ml X-Gal 和 4 µl 的 200 mg/ml IPTG。將平板在 37 C 下孵育 14-16 小時，使轉化子能夠生長。