分子克隆/蛋白質印跡
蛋白質印跡（也稱為蛋白質免疫印跡）是一種廣泛使用的分析技術，用於檢測給定組織勻漿或提取物樣品中的特定蛋白質。
樣品可以取自整個組織或細胞培養。在大多數情況下，固體組織首先使用攪拌器（對於較大的樣品體積）、勻漿器（較小的體積）或超聲波破碎進行機械分解。細胞也可以透過上述機械方法之一進行破裂。然而，細菌、病毒或環境樣本可以是蛋白質的來源，因此蛋白質印跡不僅限於細胞研究。各種洗滌劑、鹽和緩衝液可用於促進細胞裂解和溶解蛋白質。通常會新增蛋白酶和磷酸酶抑制劑以防止樣品被其自身酶消化。組織製備通常在低溫下進行，以避免蛋白質變性和降解。多種生化和機械技術——包括各種過濾和離心——可用於分離不同的細胞區室和細胞器。
為了使蛋白質能夠被抗體檢測，它們從凝膠內部轉移到由硝酸纖維素或聚偏氟乙烯 (PVDF) 製成的膜上。將膜放在凝膠頂部，並在其頂部放置一堆濾紙。將整個堆疊放在緩衝液中，緩衝液透過毛細管作用向上移動濾紙，將蛋白質帶走。另一種轉移蛋白質的方法稱為電印跡，它使用電流將蛋白質從凝膠中拉到 PVDF 或硝酸纖維素膜中。蛋白質在從凝膠內部轉移到膜的過程中，保持它們在凝膠內部的組織結構。由於這種“印跡”過程，蛋白質暴露在薄表面層上，以便進行檢測（見下文）。兩種膜都因其非特異性蛋白質結合特性而被選中（即對所有蛋白質的結合程度相同）。蛋白質結合基於疏水相互作用，以及膜和蛋白質之間的帶電相互作用。硝酸纖維素膜比 PVDF 膜便宜，但要脆弱得多，而且不能很好地承受重複探測。可以用考馬斯亮藍或 Ponceau S 染料對膜進行染色，以檢查蛋白質從凝膠轉移到膜的均勻性和整體有效性。Ponceau S 兩種染料中更常見，因為 Ponceau S 的靈敏度更高，其水溶性使其更容易像下面描述的那樣隨後脫色和探測膜。
在檢測過程中，用一種與報告酶連線的修飾抗體對膜進行“探測”，該酶在暴露於適當底物時會驅動顯色反應併產生顏色。由於各種原因，這傳統上是在兩步過程中進行的，儘管現在有一種步檢測方法可用於某些應用。
一抗
當宿主物種或免疫細胞培養物暴露於目標蛋白質（或其一部分）時，會產生一抗。通常，這是免疫反應的一部分，而在這裡，它們被收集並用作敏感且特異性的檢測工具，直接與蛋白質結合。封閉後，將稀釋的一抗溶液（通常在 0.5 到 5 微克/毫升之間）在輕微攪拌下與膜一起孵育。通常，溶液由含有少量洗滌劑的緩衝鹽溶液組成，有時還含有奶粉或 BSA。抗體溶液和膜可以密封在一起孵育 30 分鐘到過夜。它也可以在不同的溫度下孵育，溫度越高與結合越多相關，包括特異性結合（與目標蛋白質，即“訊號”）和非特異性結合（“噪聲”）。
二抗 在沖洗膜以去除未結合的一抗後，將膜暴露於另一種抗體，該抗體針對一抗的物種特異性部分。抗體來自動物來源（或動物來源的雜交瘤培養物）；抗鼠二抗將與幾乎所有鼠源性一抗結合，這使得整個實驗室可以共享一個單一的大量生產的抗體來源，從而節省了一些成本，並提供更加一致的結果。這被稱為二抗，由於其靶向特性，通常被稱為“抗鼠”、“抗羊”等。二抗通常與生物素或報告酶（如鹼性磷酸酶或辣根過氧化物酶）連線。這意味著多個二抗將與一個一抗結合，從而增強訊號。最常見的是，使用與辣根過氧化物酶連線的二抗來裂解化學發光劑，反應產物產生的發光強度與蛋白質的量成正比。將一張靈敏的感光膠片放在膜上，曝光於反應產生的光線會產生抗體與印跡結合的影像。更便宜但靈敏度較低的方法使用 1% 過氧化氫的 4-氯萘酚染色；過氧化物自由基與 4-氯萘酚的反應產生深棕色染色，可以在不使用特殊感光膠片的情況下進行拍照。
在沖洗掉未結合的探針後，蛋白質印跡就可以準備好檢測標記並與目標蛋白質結合的探針了。實際上，並非所有蛋白質印跡都在膜上的一個條帶處顯示蛋白質。透過將染色條帶與電泳期間載入的標記或梯子的條帶進行比較，可以獲得大小近似值。該過程針對結構蛋白（如肌動蛋白或微管蛋白）重複進行，這些蛋白在樣本之間不應發生變化。將目標蛋白的量索引到結構蛋白以控制組間。這種做法確保校正膜上總蛋白的量，以防出現錯誤或轉移不完全。
顯色檢測 顯色檢測方法依賴於蛋白質印跡與底物的孵育，該底物與與二抗結合的報告酶（如過氧化物酶）反應。這將可溶性染料轉化為不同顏色的不溶性形式，該形式在酶旁邊沉澱下來，從而使膜染色。然後透過洗掉可溶性染料來停止印跡的顯影。透過光密度法（染色的強度）或分光光度法評估蛋白質水平。
化學發光檢測 化學發光檢測方法依賴於蛋白質印跡與底物的孵育，該底物在暴露於二抗上的報告酶時會發光。然後透過感光膠片檢測光線，而最近則是透過 CCD 相機檢測光線，CCD 相機捕獲蛋白質印跡的數字影像。透過光密度法分析影像，該方法評估蛋白質染色的相對量，並以光密度來量化結果。如果使用適當的標準，新的軟體可以進行進一步的資料分析，例如分子量分析。
熒光檢測 熒游標記的探針受到光的激發，然後透過配備有適當發射濾光片的 CCD 相機等光感測器檢測激發的發射，該相機捕獲蛋白質印跡的數字影像，並允許進行進一步的資料分析，例如分子量分析和定量蛋白質印跡分析。熒光被認為是蛋白質印跡分析中最靈敏的檢測方法之一。
二次探測 硝酸纖維素膜和 PVDF 膜之間的主要區別之一是它們支援將抗體從膜上“剝離”並重復使用膜進行後續抗體探測的能力。雖然有完善的協議可用於剝離硝酸纖維素膜，但更堅固的 PVDF 膜更容易剝離，並且可以在背景噪聲限制實驗之前重複使用多次。另一個區別是，與硝酸纖維素不同，PVDF 必須在使用前浸泡在 95% 的乙醇、異丙醇或甲醇中。PVDF 膜也往往更厚，在使用過程中更耐損壞。