生物化學/細胞代謝 I 原理：DNA 複製

DNA 聚合酶在 DNA 鏈的 5' 端新增核苷酸。 如果意外摻入了錯配，則聚合酶會被抑制，無法繼續延伸。校對功能會移除錯配的核苷酸，並繼續延伸。

DNA 複製是發生在所有生物體中的生物學過程，複製它們的 DNA；它是生物遺傳的基礎。該過程從一個雙鏈 DNA 分子開始，產生兩個相同複製的分子。原始雙鏈 DNA 分子的每條鏈都作為模板來產生互補鏈。細胞校對和錯誤校正機制確保 DNA 複製具有近乎完美的保真度。在細胞中，DNA 複製從基因組中的特定位置開始，稱為“起點”。在起點處 DNA 解旋，以及新鏈的合成，形成複製叉。除了 DNA 聚合酶（透過新增與模板鏈匹配的核苷酸來合成新 DNA 的酶）之外，許多其他蛋白質與複製叉相關聯，並輔助 DNA 合成的起始和延續。DNA 複製也可以在體外（人工，在細胞外）進行。從細胞中分離出來的 DNA 聚合酶和人工 DNA 引物用於在模板分子中已知序列處啟動 DNA 合成。聚合酶鏈式反應（PCR）是一種常見的實驗室技術，它以迴圈方式使用這種人工合成來從 DNA 池中擴增特定的靶 DNA 片段。

複製

複製叉的示意圖。
a: 模板，b: 領先鏈，c: 滯後鏈，d: 複製叉，e: 引物，f: 岡崎片段

在細胞中，DNA 複製從基因組中的特定位置開始，稱為“起點”。在起點處 DNA 解旋，以及新鏈的合成，形成複製叉。除了 DNA 聚合酶（透過新增與模板鏈匹配的核苷酸來合成新 DNA 的酶）之外，許多其他蛋白質與複製叉相關聯，並輔助 DNA 合成的起始和延續。DNA 複製也可以在體外（在細胞外）進行。從細胞中分離出來的 DNA 聚合酶和人工 DNA 引物用於在模板分子中已知序列處啟動 DNA 合成。聚合酶鏈式反應（PCR）是一種常見的實驗室技術，它以迴圈方式使用這種人工合成來從 DNA 池中擴增特定的靶 DNA 片段。

領先鏈

領先鏈模板是 DNA 雙螺旋的模板鏈，其方向為 3' 到 5'。所有 DNA 合成都發生在 5'-3'。原始 DNA 鏈必須以 3'-5' 方向讀取才能產生 5'-3' 新生鏈。領先鏈沿領先鏈模板形成，因為聚合酶“讀取”模板 DNA 並不斷地將核苷酸新增到正在延伸的鏈的 3' 端。這種聚合酶是原核生物中的 DNA 聚合酶 III（DNA Pol III），據推測是真核生物中的 Pol ε。

滯後鏈

滯後鏈模板是 DNA 雙螺旋的編碼鏈，其方向為 5' 到 3'。新合成的滯後鏈仍然以 5'-3' 方向合成。但是，由於 DNA 的方向不允許連續合成，因此一次只能讀取一小段。一個 RNA 引物被放置在 DNA 鏈上，該鏈位於複製起點 3' 處。與以前一樣，DNA 聚合酶以 3'-5' 方向讀取原始 DNA，以產生 5'-3' 新生鏈。聚合酶到達複製起點並停止複製，直到一個新的 RNA 引物被放置在最後一個 RNA 引物 3' 處。在滯後鏈上產生的這些 DNA 片段被稱為岡崎片段。滯後鏈上原始 DNA 的方向阻止了連續合成。因此，滯後鏈的複製比領先鏈更復雜。在滯後鏈模板上，引物酶“讀取”DNA 並將其上的 RNA 新增到短的、分離的片段中。在真核生物中，引物酶是 Pol α 的固有部分。DNA 聚合酶 III 或 Pol δ 延長了引物片段，形成了岡崎片段。真核生物中引物的去除也是由 Pol δ 完成的。在原核生物中，DNA 聚合酶 I “讀取”這些片段，使用其瓣狀核酸內切酶結構域去除 RNA，並用 DNA 核苷酸替換 RNA 核苷酸（這是必要的，因為 RNA 和 DNA 使用略微不同的核苷酸）。DNA 連線酶將這些片段連線在一起。

岡崎片段

岡崎片段是 DNA 複製過程中在滯後鏈上產生的相對較短的 DNA 片段（在 5' 末端沒有 RNA 引物）。在大腸桿菌中，岡崎片段的長度在 1,000 到 2,000 個核苷酸之間，在真核生物中通常在 100 到 200 個核苷酸之間。它是 1968 年由岡崎令治、岡崎恆子和他們的同事在研究大腸桿菌中噬菌體 DNA 複製時首次發現的。

DNA 複製。雙螺旋被解旋酶和拓撲異構酶解旋。接下來，一個 DNA 聚合酶產生領先鏈複製。另一個 DNA 聚合酶與滯後鏈結合。這種酶在 DNA 連線酶將它們連線在一起之前，會製造不連續的片段（稱為岡崎片段）。

DNA 聚合酶的分類

基於序列同源性，DNA 聚合酶被細分為七個不同的家族：A、B、C、D、X、Y 和 RT。

1. A 家族聚合酶包含複製和修復聚合酶。來自該家族的複製成員包括經過廣泛研究的 T7 DNA 聚合酶，以及真核生物線粒體 DNA 聚合酶 γ。修復聚合酶中包括大腸桿菌 DNA pol I、嗜熱棲熱菌 pol I 和嗜熱脂肪芽孢桿菌 pol I。這些修復聚合酶參與切除修復和滯後鏈合成過程中產生的岡崎片段的加工。

2. B 家族在 XPV 患者中，備用易錯聚合酶，例如 Pol ζ（zeta）（聚合酶 ζ 是 B 家族聚合酶，是催化亞基 REV3L 與 Rev7 的複合物，與 Rev1 相關聯），被認為參與導致這些患者癌症易感性的錯誤。屬於 B 家族的 DNA 聚合酶包含 DTDS 基序。其他成員是 Pol ε、Pol α、Pol δ。

3. C 家族聚合酶是主要的細菌染色體複製酶。來自大腸桿菌的 DNA 聚合酶 III α 亞基是催化亞基，沒有已知的核酸酶活性。另一個亞基，ε 亞基，具有在染色體複製過程中用於編輯的 3'-5' 外切核酸酶活性。最近的研究已將 C 家族聚合酶歸類為 X 家族的子類別。

4. D 家族聚合酶的特徵仍然不太清楚。所有已知的例子都存在於古細菌域的廣古菌亞域，被認為是複製聚合酶。

5.X 家族 包含著名的真核聚合酶 pol β，以及其他真核聚合酶，如 pol σ、pol λ、pol μ 和末端脫氧核苷酸轉移酶 (TdT)。Pol β 是短片段鹼基切除修復所必需的，這是一種 DNA 修復途徑，對於修復無鹼基位點至關重要。Pol λ 和 Pol μ 參與非同源末端連線，這是一種重新連線 DNA 雙鏈斷裂的機制。TdT 僅在淋巴組織中表達，並在 V(D)J 重組過程中形成的雙鏈斷裂處新增“n 個核苷酸”，以促進免疫多樣性。酵母菌 Saccharomyces cerevisiae 只有一個 Pol X 聚合酶，Pol IV，參與非同源末端連線。

6.Y 家族 Y 聚合酶在無損模板上的保真度較低，並且能夠複製穿過受損的 DNA。 因此，這個家族的成員被稱為跨損傷合成 (TLS) 聚合酶。根據損傷，TLS 聚合酶可以以無誤或易錯的方式繞過損傷，後者會導致突變率升高。例如，色素性幹皮病變異型 (XPV) 患者的 Pol η (η) 編碼基因發生突變，該基因對紫外線損傷無錯。人類的其他成員是 Pol ι (ι)、Pol κ (κ) 和 Rev1 (末端脫氧胞嘧啶轉移酶)。在大腸桿菌中，已知兩種 TLS 聚合酶，Pol IV (DINB) 和 Pol V (UmuD'2C)。

7.逆轉錄酶 (RT) 家族 逆轉錄酶家族包含來自逆轉錄病毒和真核聚合酶的例子。真核聚合酶通常僅限於端粒酶。這些聚合酶使用 RNA 模板合成 DNA 鏈。

DNA 複製是半保留的

三種假定的 DNA 合成方法的總結

梅塞爾森和斯塔爾實驗是由 馬修·梅塞爾森 和 弗蘭克林·斯塔爾 在 1958 年進行的，它支援了 DNA 複製 是半保留的假設。半保留複製意味著當雙鏈 DNA 螺旋複製時，兩個雙鏈 DNA 螺旋體中，每個螺旋體都包含來自原始螺旋體的一條鏈和一條新合成的鏈。它被稱為“生物學中最美麗的實驗”。"

之前已經提出了三種關於 DNA 複製方法的假設。

在 半保留 假說中，由 沃森 和 克里克 提出的，DNA 分子的兩條鏈在複製過程中分離。然後，每條鏈充當合成新鏈的模板 。

保守 假說提出，整個 DNA 分子充當合成一個全新 DNA 分子的模板。根據這個模型，組蛋白 蛋白質與 DNA 結合，以這樣的方式扭曲 DNA，以便為氫鍵暴露兩條鏈的鹼基 。

分散 假說以 馬克斯·德爾布呂克 提出的模型為例，該模型試圖透過一種機制來解決解開雙螺旋的兩條鏈的問題，這種機制每 10 個核苷酸左右就會斷裂一次 DNA 骨架，解開分子，並將舊鏈連線到新合成的鏈的末端。這將在短片段中合成 DNA，這些片段在一條鏈和另一條鏈之間交替 。

這三種模型中的每一種對複製後形成的分子中“舊”DNA 的分佈做出了不同的預測。在保守假說中，複製後，一個分子是完全保留的“舊”分子，另一個分子是全部新合成的 DNA。半保留假說預測，複製後的每個分子將包含一條舊鏈和一條新鏈。分散模型預測，每個新分子的每條鏈將包含舊 DNA 和新 DNA 的混合物 。

半保留理論可以透過利用 DNA 由氮鹼基組成的這一事實來證實。氮具有稱為重氮的同位素 N15 (N14 是最常見的同位素)。證實半保留理論的預測的實驗利用了這種同位素，並按如下步驟進行：細菌 (大腸桿菌) DNA 被放置在含有重氮 (N15) 的培養基中，重氮與 DNA 結合，使其可識別。然後將這種 DNA 放置在含有 N14 的培養基中，並使其僅複製一次。新的鹼基將包含氮 14，而原來的將包含 N15。將 DNA 放置在含有氯化銫 (重化合物) 的試管中，並在 40,000 轉/分鐘的速度下離心。氯化銫分子沉到底部，形成密度梯度。DNA 分子將定位在其相應的密度水平 (考慮到 N15 比 N14 密度更大)。在紫外線下觀察這些試管。DNA 在試管中以不同高度出現，具體取決於它們的密度。根據半保留理論，在 DNA 複製一次後，我們應該從 DNA 的每條原始鏈中獲得 2 個雜交 (部分 N14 部分 N15) 分子。這將在試管中顯示為一條線。分散理論的結果將相同。另一方面，根據保守理論，我們應該獲得一條原始 DNA 鏈和一條全新的鏈，即試管中分別放置的兩條細線。到目前為止，半保留理論或分散理論可能是真實的，因為實驗證據證實，在複製一次後只出現一條線。為了得出這兩個理論之間的結論，必須讓 DNA 再次複製，仍然在含有 N14 的培養基中。在分散理論中，經過 2 次分裂後，我們應該獲得一條線，但試管中更高，因為 DNA 分子隨著 N14 在分子中變得更加豐富而變得密度更低。根據半保留理論，應該產生 2 個雜交分子和 2 個完全 N14 分子，因此在試管中應該觀察到不同高度的兩條細線。實驗證據證實，觀察到兩條線，因此為半保留理論提供了有力的證據 。

遺傳證據

最近，對單個突變細菌進行的高通量基因組測序提供了對半保留理論的獨立“遺傳”證據。大腸桿菌 被甲磺酸乙酯 (EMS) 處理，已知 EMS 會誘導 G:C → A:T 轉換，因為會生成異常鹼基 O-6-乙基鳥嘌呤，該鹼基在 DNA 複製過程中會被錯誤識別並與 T 配對而不是 C。來自 EMS 突變細菌的單個菌落的測序 DNA 表明，僅 G → A 或 C → T 轉換的長片段，在某些情況下跨越了整個細菌基因組。對這種現象的基本解釋基於半保留機制：人們應該預期子鏈在複製後分離到不同的細胞中，這會導致每個後代細胞僅具有 G → A 或 C → T 轉換。

氮 是 DNA 的主要組成部分。¹⁴N 迄今為止是氮最豐富的同位素，但帶有較重 (但非放射性) ¹⁵N 同位素的 DNA 也是功能性的。

大腸桿菌 在含有 ¹⁵N 的培養基中生長了多代。當從這些細胞中提取 DNA 並將其在鹽密度梯度上離心時，DNA 會在密度等於鹽溶液密度的點分離。在 ¹⁵N 培養基中生長的細胞的 DNA 比在正常 ¹⁴N 培養基中生長的細胞的 DNA 密度更高。之後，將只有 ¹⁵N DNA 的 大腸桿菌 細胞轉移到 ¹⁴N 培養基中，並允許其分裂；透過測量細胞懸浮液的光密度來監測細胞分裂的程序。

定期提取 DNA，並將其與純 ¹⁴N DNA 和 ¹⁵N DNA 進行比較。複製一次後，發現 DNA 的密度接近中間值。由於保守複製會導致等量的較高和較低密度的 DNA (但沒有中間密度的 DNA)，因此排除了保守複製。但是，此結果與半保留複製和分散複製是一致的。半保留複製將導致雙鏈 DNA，其中一條鏈是 ¹⁵N DNA，另一條是 ¹⁴N DNA，而分散複製將導致雙鏈 DNA，其中兩條鏈都具有 ¹⁵N 和 ¹⁴N DNA 的混合物，兩者都將顯示為中間密度的 DNA。

作者繼續對細胞進行取樣，以繼續複製。發現已完成兩次複製的細胞的 DNA 由等量的兩種不同密度的 DNA 組成，一種對應於在 ¹⁴N 培養基中僅分裂一次的細胞的 DNA 的中間密度，另一種對應於僅在 ¹⁴N 培養基中生長的細胞的 DNA。這與分散複製不一致，分散複製會導致單一密度，低於一代細胞的中間密度，但仍高於僅在 ¹⁴N DNA 培養基中生長的細胞的密度，因為原始 ¹⁵N DNA 會均勻地分佈在所有 DNA 鏈中。結果與半保留複製假設一致 。

真核生物中的 DNA 複製

人類 DNA 聚合酶 beta 中的 DNA 結合 螺旋-轉角-螺旋 基序的 3D 結構

真核生物中的 DNA 複製比原核生物中的複雜得多，儘管存在許多相似的方面。真核細胞只能在細胞週期的特定時間點，即S 期開始時啟動 DNA 複製。

真核生物的 DNA 複製僅發生在細胞週期的 S 期。然而，預起始發生在 G1 期。因此，預起始和啟用的分離確保了複製起點只能在每個細胞週期中啟動一次。由於真核生物染色體體積龐大，真核生物染色體包含**多個複製起點**。有些起點得到很好的表徵，例如酵母的**自主複製序列 (ARS)**，而其他真核生物的起點，特別是後生動物的起點，可以在數千個鹼基對的範圍內找到。

真核 DNA 聚合酶

已知至少有 15 種真核 DNA 聚合酶

POLA1, POLA2: Pol α（也稱為 RNA 引物酶）：與一個小的催化亞基 (PriS) 和一個大的非催化亞基 (PriL) 形成複合物，Pri 亞基充當引物酶（合成 RNA 引物），然後 DNA Pol α 用 DNA 核苷酸延伸該引物。大約 20 個核苷酸後[3]，延伸由 Pol ε（在引導鏈上）和 δ（在滯後鏈上）接管。

POLB: Pol β：參與修復 DNA，包括鹼基切除修復和缺口填充合成。

POLG, POLG2: Pol γ：複製和修復線粒體 DNA，並具有校對 3'->5' 核酸外切酶活性。

POLD1, POLD2, POLD3, POLD4: Pol δ：具有高度的加工能力，並具有校對 3'->5' 核酸外切酶活性。被認為是參與滯後鏈合成的主要聚合酶，但其作用仍存在爭議。

POLE, POLE2, POLE3: Pol ε：也是高度加工的，並具有校對 3'->5' 核酸外切酶活性。與 Pol δ 非常相似，被認為是參與引導鏈合成的主要聚合酶[5]，但其作用再次存在爭議。

POLH, POLI, POLK, : η、ι、κ 和 Rev1 是 Y 家族 DNA 聚合酶，Pol ζ 是 B 家族 DNA 聚合酶。這些聚合酶參與繞過 DNA 損傷。

還有一些其他的真核聚合酶，但它們的特徵還不清楚：POLQ：'θ POLL：λ φ σ POLM：μ 沒有任何真核聚合酶能夠去除引物（5'->3' 核酸外切酶活性）；該功能由其他酶執行。只有處理延伸的聚合酶（γ、δ 和 ε）具有校對能力（3'->5' 核酸外切酶）。

G1 期的準備

DNA 複製的第一步是形成預起始複製複合物（pre-RC）。這種複合物的形成分兩個階段。第一階段要求沒有 CDK 活性。這隻能在 G1 期早期發生。pre-RC 的形成被稱為許可，但許可的 pre-RC 無法在G1 期啟動複製。目前的模型認為，它始於複製起點識別複合物 (ORC) 與複製起點的結合。該複合物是六聚體相關蛋白，即使在 DNA 複製發生後也會與複製起點結合。此外，ORC 是原核生物 DnaA 的功能類似物。在 ORC 與複製起點結合後，Cdc6/Cdc18 和 Cdt1 透過首先與 ORC 結合，然後與 MCM（微型染色體維持）複合物結合，來協調 MCM 複合物在複製起點上的載入。MCM 複合物被認為是真核生物中主要的 DNA 解旋酶。一旦 MCM 結合發生，就會形成一個完全許可的 pre-RC。

S 期進行復制

複合物的啟用發生在 S 期，需要 Cdk2-Cyclin E 和 Ddk。啟用過程始於 Mcm10 加入 pre-RC，取代 Cdt1。在此之後，Ddk 磷酸化 Mcm3-7，啟用解旋酶。據信，ORC 和 Cdc6/18 被 Cdk2-Cyclin E 磷酸化。Ddk 和 Cdk 複合物隨後募集另一種稱為 Cdc45 的蛋白，然後將所有 DNA 複製蛋白募集到複製叉。在這個階段，複製起點被啟動，DNA 合成開始。新的複製輪次的啟動被細胞週期蛋白依賴性激酶和一種稱為 geminin 的蛋白的作用所阻止。Geminin 與 Cdt1 結合並將其隔離。它是一種週期性蛋白，首先出現在 S 期，並在 M 期後期被降解，可能是通過後期促進複合物 (APC) 的作用。此外，Cdc6/18 的磷酸化阻止其與 ORC 結合（從而抑制 MCM 複合物的載入），而 ORC 的磷酸化尚不清楚。處於細胞週期的 G0 期的細胞無法啟動一輪複製，因為 Mcm 蛋白沒有表達。

至少三種不同的真核 DNA 聚合酶參與動物細胞中的 DNA 複製（POL α、Pol δ 和 POL ε）。

Pol α 與一個小的催化亞基 (PriS) 和一個大的非催化亞基 (PriL) 形成複合物，Pri 亞基充當引物酶（合成 RNA 引物），然後 DNA Pol α 用 DNA 核苷酸延伸該引物。大約 20 個核苷酸後，延伸由 Pol ε（在引導鏈上）和 δ（在滯後鏈上）接管。

Pol δ：具有高度的加工能力，並具有校對 3'->5' 核酸外切酶活性。被認為是參與引導鏈合成的主要聚合酶，但其作用仍存在爭議。

Pol ε：也是高度加工的，並具有校對 3'->5' 核酸外切酶活性。與 Pol δ 非常相似，被認為是參與滯後鏈合成的主要聚合酶[，但其作用再次存在爭議。

原核生物的 DNA 複製

原核生物的 DNA 複製在 E. coli 中得到廣泛研究。它是雙向的，起源於單個複製起點**（OriC）**。

引物酶

在細菌中，引物酶與 DNA 解旋酶結合形成稱為引物體的複合物。引物酶被 DNA 解旋酶啟用，然後合成大約 11 ±1 個核苷酸長的短 RNA 引物，新的核苷酸可以由 DNA 聚合酶新增到該引物上。

引物體

引物體是一種蛋白質複合物，負責在 DNA 複製過程中在單鏈 DNA 上建立 RNA 引物。引物體是核蛋白組裝體，可以啟用 DNA 複製叉。它們的主要作用是將複製性解旋酶募集到單鏈 DNA 上。在埃希氏大腸桿菌中定義的“複製重啟”引物體參與了停滯的複製叉的重新啟用。

埃希氏大腸桿菌引體物的組裝需要六種蛋白，PriA、PriB、PriC、DnaB、DnaC 和 DnaT，在 SSB 包裹的單鏈 (8s) DNA 上的引物體組裝位點 (pas) 上起作用。組裝由 PriA 和 PriB 與 ssDNA 和 pas 的相互作用啟動。PriC、DnaB、DnaC 和 DnaT 然後作用於 PriA-PriB-DNA 複合物以產生引物體。

引物體包含**七種蛋白**：**DnaG** 引物酶、**DnaB** 解旋酶、**DnaC** 解旋酶輔助蛋白、**DnaT、PriA、Pri B** 和**PriC**。引物體在 DNA 引導鏈上使用一次，在滯後 DNA 鏈上重複使用，啟動每個岡崎片段。最初，由**PriA、PriB 和 PriC** 形成的複合物與 DNA 結合。然後，DnaB-DnaC 解旋酶複合物與**DnaT** 一起附著。這種結構被稱為**預引物體**。最後，**DnaG** 將與預引物體結合形成完整的引物體。引物體將 1-10 個 RNA 核苷酸附著到單鏈 DNA 上，建立一個 DNA-RNA 雜交體。該 RNA 序列被用作引物來啟動 DNA 聚合酶 III。RNA 鹼基最終被 RNase H 核酸酶（真核生物）或 DNA 聚合酶 I 核酸酶（原核生物）替換為 DNA 鹼基。然後，DNA 連線酶起作用將兩端連線在一起。

DNA 鏈的延伸

一旦引物完成，DNA 聚合酶 III 全酶就被載入到 DNA 中，複製開始。DNA 聚合酶 III 的催化機制涉及在活性位點使用兩種金屬離子，以及活性位點中一個能夠區分脫氧核苷酸和核苷酸的區域。金屬離子是一般二價陽離子，它們幫助 3' OH 啟動對脫氧核苷酸的α磷酸的親核攻擊，並定位和穩定脫氧核苷酸上的帶負電的磷酸三酯。3' OH 對α磷酸的親核攻擊釋放焦磷酸，然後焦磷酸被無機磷酸酶水解成兩個磷酸。這種水解促使 DNA 合成完成。

此外，DNA 聚合酶 III 必須能夠區分正確配對的鹼基和錯誤配對的鹼基。這是透過使用一個形狀與正確配對核苷酸結構互補的活性位點口袋來區分沃森-克里克鹼基對來實現的。這個口袋有一個酪氨酸殘基，能夠與正確配對的核苷酸形成範德華相互作用。此外，活性位點的 dsDNA（雙鏈 DNA）具有更寬、更淺的次要溝，允許與嘌呤鹼基的第三個氮原子和嘧啶鹼基的第二個氧原子形成氫鍵。最後，活性位點與 DNA 骨架形成大量的氫鍵。這些相互作用導致 DNA 聚合酶 III 圍繞一個正確配對的鹼基閉合。如果插入一個鹼基並且錯誤配對，這些相互作用將無法發生，因為氫鍵和範德華相互作用會受到干擾。

DNA 以 3' → 5' 方向讀取，因此，核苷酸以 5' → 3' 方向合成（或連線到模板鏈）。然而，一條親本 DNA 鏈是 3' → 5'，而另一條是 5' → 3'。為了解決這個問題，複製在相反的方向進行。朝向複製叉移動，**引導鏈以連續的方式合成**，只需要一個引物。另一方面，**滯後鏈**，遠離複製叉移動，以一系列**稱為岡崎片段的短片段**合成，因此需要多個引物。岡崎片段的 RNA 引物隨後被 RNAse H 和 DNA 聚合酶 I（核酸外切酶）降解，缺口（或切口）被脫氧核苷酸填充，並透過連線酶密封。

終止

大腸桿菌 DNA 複製的終止是透過使用終止序列和Tus蛋白完成的。Tus 是一種序列特異性 DNA 結合蛋白，它促進原核生物 DNA 複製的終止。在大腸桿菌中，Tus 結合細菌染色體中編碼的十個密切相關的 23 個鹼基對結合位點。這些位點稱為Ter 位點，分別命名為TerA、TerB、…、TerJ。結合位點是不對稱的，因此當一個 Tus-Ter 複合物（Tus 蛋白與 Ter 位點結合）遇到來自一個方向的複製叉時，該複合物會解離，複製繼續進行（允許的）。然而，當從另一個方向遇到時，Tus-Ter 複合物提供了更大的動力學屏障，並停止了複製（不允許的）。染色體中的多個 Ter 位點是定向的，使得兩個相反方向移動的複製叉都在所需的終止區域停滯。

DNA 損傷及其修復

由於環境因素和細胞內部的正常代謝過程，DNA 損傷每天以每個細胞 1,000 到 1,000,000 個分子病變的速率發生。雖然這僅佔人類基因組約 60 億個鹼基（30 億個鹼基對）的 0.000165%，但關鍵基因（如腫瘤抑制基因）中未修復的病變會阻礙細胞執行其功能並顯著增加腫瘤形成的可能性。

絕大多數 DNA 損傷影響雙螺旋結構的主要結構；也就是說，鹼基本身被化學修飾。這些修飾反過來可以透過引入非天然化學鍵或不適合標準雙螺旋結構的龐大加合物來破壞分子的規則螺旋結構。與蛋白質和 RNA 不同，DNA 通常缺乏三級結構，因此損傷或干擾不會發生在該級別。然而，DNA 是超螺旋的，並纏繞在稱為組蛋白的“包裝”蛋白周圍（在真核生物中），兩種超結構都容易受到 DNA 損傷的影響。

DNA 損傷型別

直接 DNA 損傷：UV 光子被 DNA 直接吸收（左）。激發態可能發生的反應之一是形成胸腺嘧啶-胸腺嘧啶環丁烷二聚體（右）。直接 DNA 損傷會導致曬傷，導致黑色素生成增加，從而導致永續性曬黑。然而，它僅佔所有黑色素瘤的 8%。

由於內源性細胞過程，DNA 損傷主要有五種型別：鹼基氧化 [例如 8-氧代-7,8-二氫鳥嘌呤 (8-oxoG)] 和活性氧物種產生的 DNA 鏈斷裂，鹼基烷基化（通常是甲基化），例如形成 7-甲基鳥嘌呤、1-甲基腺嘌呤、6-O-甲基鳥嘌呤，鹼基水解，例如脫氨基、脫嘌呤和脫嘧啶。“龐大加合物的形成”（即苯並 [a] 芘二醇環氧化物-dG 加合物）鹼基錯配，由於 DNA 複製錯誤，其中錯誤的 DNA 鹼基縫合到新形成的 DNA 鏈中，或者 DNA 鹼基被跳過或錯誤地插入。由外源性因素造成的損傷 由外源性因素造成的損傷形式多種多樣。以下描述了一些示例。

UV-B 光會導致相鄰胞嘧啶和胸腺嘧啶鹼基之間發生交聯，形成嘧啶二聚體。這稱為直接 DNA 損傷。

UV-A 光主要產生自由基。自由基造成的損傷稱為間接 DNA 損傷。

電離輻射（如放射性衰變或宇宙射線產生的輻射）會導致 DNA 鏈斷裂。低劑量電離輻射可能誘導不可修復的 DNA 損傷（導致腫瘤形成所需的複製和轉錄錯誤，或可能觸發病毒相互作用），從而導致早衰和癌症。

高溫下的熱擾動會增加脫嘌呤（從 DNA 骨架中丟失嘌呤鹼基）和單鏈斷裂的速率。例如，水解脫嘌呤在嗜熱菌中可見，嗜熱菌在 40-80 °C 的溫泉中生長。這些物種中的脫嘌呤率（每個基因組每個世代 300 個嘌呤殘基）太高，無法透過正常的修復機制修復，因此不能排除適應性反應的可能性。

工業化學品在 DNA 損傷中也起著非常重要的作用，例如氯乙烯和過氧化氫，以及環境化學品，例如在煙霧、菸灰和焦油中發現的多環芳烴，會產生大量的 DNA 加合物——乙烯鹼基、氧化鹼基、烷基化磷酸三酯和 DNA 交聯，僅舉幾例。UV 損傷、烷基化/甲基化、X 射線損傷和氧化損傷是誘導損傷的例子。自發性損傷可能包括鹼基丟失、脫氨基、糖環扭結和互變異構體轉換。

損傷來源

DNA 損傷可以細分為兩種主要型別

內源性損傷，例如由正常代謝副產物產生的活性氧物種的攻擊（自發突變），

尤其是氧化脫氨基過程

還包括複製錯誤

外源性損傷，由外部因素引起，例如

來自太陽的紫外線 [UV 200-300nm] 輻射

其他輻射頻率，包括 X 射線和伽馬射線

水解或熱擾動

某些植物毒素

人造誘變劑化學物質，尤其是作為 DNA 插層劑的芳香族化合物

癌症化療和放射治療

病毒

轉換 在分子生物學中，轉換是指將嘌呤核苷酸更改為另一個嘌呤 (A ↔ G) 或將嘧啶核苷酸更改為另一個嘧啶 (C ↔ T) 的點突變。大約三分之二的單核苷酸多型性 (SNP) 是轉換。轉換可能是由氧化脫氨基和互變異構化引起的。儘管可能發生的顛換是轉換的兩倍，但轉換在基因組中出現的頻率更高，這可能是由於產生轉換的分子機制造成的。5-甲基胞嘧啶比未甲基化的胞嘧啶更容易發生轉換，這是由於自發脫氨基。這種機制很重要，因為它決定了 CpG 島的稀有性。

顛換 在分子生物學中，顛換是指將嘌呤替換為嘧啶或反之。它只能透過自發的回覆突變來回復。由於這種型別的突變會顯著改變化學結構，因此這種變化的後果往往比轉換更嚴重，也更不常見。顛換可能是由電離輻射和烷基化劑引起的。

NER 機制中的缺陷會導致幾種遺傳疾病，包括

色素性幹皮病：對陽光/紫外線的過度敏感，導致皮膚癌發生率增加和早衰

科凱恩綜合徵：對紫外線和化學物質的過度敏感

毛髮硫磺營養不良：皮膚敏感，頭髮和指甲易碎，智力障礙通常伴隨後兩種疾病，表明發育神經元的脆弱性增加。

其他 DNA 修復障礙包括

維爾納綜合徵：早衰和生長遲緩

布魯姆綜合徵：對陽光的過度敏感，惡性腫瘤發生率高（尤其是白血病）。

共濟失調毛細血管擴張症：對電離輻射和某些化學物質的敏感性

所有上述疾病通常被稱為“節段性早衰”（“加速衰老疾病”），因為它們的受害者在異常年輕的年齡看起來很老，並患有與衰老相關的疾病，但沒有表現出所有衰老的症狀。

與 DNA 修復功能降低相關的其他疾病包括範可尼貧血、遺傳性乳腺癌和遺傳性結腸癌。

聚合酶鏈反應或 PCR

圖 1：PCR 迴圈的示意圖。（1）在 94–96 °C 下變性。 （2）在 ~65 °C 下退火 （3）在 72 °C 下延伸。這裡顯示了四個迴圈。藍線代表 DNA 模板，引物（紅色箭頭）與之退火，這些引物由 DNA 聚合酶（淺綠色圓圈）延伸，得到更短的 DNA 產物（綠色線），這些產物本身用作 PCR 程序中的模板。

1971 年，Kleppe 及其同事在《分子生物學雜誌》上發表了一篇論文，首次描述了一種使用酶法分析在體外用引物複製短 DNA 模板的方法。然而，這種早期體現 PCR 基本原理的方法並沒有引起太多關注，1983 年發明的聚合酶鏈式反應（PCR）通常被認為是 Kary Mullis 的功勞。PCR 方法的核心是使用合適的 DNA 聚合酶，這種聚合酶能夠承受超過 90 °C（194 °F）的高溫，這些高溫是每次複製迴圈後使 DNA 雙螺旋中的兩條 DNA 鏈分離所需的。最初用於 PCR 預兆的體外實驗的 DNA 聚合酶無法承受這些高溫。因此，早期的 DNA 複製程式效率很低，耗時長，需要大量的 DNA 聚合酶，並且在整個過程中需要持續操作。1976 年發現的 Taq 聚合酶是一種從嗜熱細菌——熱泉菌中提取的 DNA 聚合酶，這種細菌自然生長在溫泉等高溫（50 到 80 °C（122 到 176 °F））的環境中，為 PCR 方法的顯著改進鋪平了道路。從熱泉菌中分離出的 DNA 聚合酶在高溫下穩定，即使在 DNA 變性後也能保持活性，因此無需在每次迴圈後新增新的 DNA 聚合酶。這使得基於自動熱迴圈儀的 DNA 擴增過程成為可能。當 Mullis 在 1983 年開發 PCR 時，他在加州埃默裡維爾為 Cetus 公司工作，Cetus 公司是第一批生物技術公司之一。在那裡，他負責合成短鏈 DNA。Mullis 在他的著作中寫道，他是在一個晚上開車沿著太平洋海岸公路行駛時想到 PCR 的。他當時正在思考分析 DNA 變化（突變）的新方法，這時他意識到，他發明了一種透過 DNA 聚合酶驅動的重複複製迴圈來擴增任何 DNA 區域的方法。在《科學美國人》雜誌上，Mullis 總結了這種方法：“從單個遺傳物質 DNA 分子開始，PCR 可以在一個下午內產生 1000 億個類似的分子。這種反應很容易執行，只需要一個試管、一些簡單的試劑和一個熱源。”他於 1993 年因其發明獲得了諾貝爾化學獎，這是他和他 Cetus 公司的同事首次將他的提議付諸實踐七年後。然而，關於其他科學家對 Mullis 工作的智力和實際貢獻，以及他是否為 PCR 原理的唯一發明者，一直存在一些爭議。

PCR

PCR 用於擴增 DNA 鏈的特定區域（DNA 目標）。大多數 PCR 方法通常擴增長達約 10 千鹼基對 (kb) 的 DNA 片段，儘管某些技術允許擴增長達 40 kb 的片段。基本的 PCR 設定需要幾種組分和試劑。這些組分包括

含有待擴增 DNA 區域（目標）的 DNA 模板。

兩個引物，它們分別與 DNA 目標的正義鏈和反義鏈的 3'（3 素）末端互補。Taq 聚合酶或其他在約 70 °C 下具有最佳溫度的 DNA 聚合酶。脫氧核苷酸三磷酸 (dNTP)，這是 DNA 聚合酶合成新的 DNA 鏈的構建塊。緩衝液，為 DNA 聚合酶提供最佳活性及穩定性的合適化學環境。二價陽離子，鎂或錳離子；通常使用 Mg2+，但 Mn2+ 可用於 PCR 介導的 DNA 誘變，因為更高的 Mn2+ 濃度會增加 DNA 合成過程中的錯誤率。一價陽離子鉀離子。PCR 通常在熱迴圈儀中以 10-200 μl 的反應體積進行，在小反應管（0.2-0.5 ml 體積）中進行。熱迴圈儀對反應管進行加熱和冷卻，以在反應的每個步驟（見下文）實現所需的溫度。許多現代熱迴圈儀利用珀耳帖效應，透過簡單地反轉電流就可以加熱和冷卻容納 PCR 管的塊體。薄壁反應管允許良好的熱傳導，從而實現快速熱平衡。大多數熱迴圈儀都有加熱蓋，以防止反應管頂部出現冷凝。沒有加熱蓋的舊熱迴圈儀需要在反應混合物頂部加一層油，或者在管內放一個蠟球。

程式

圖 1：PCR 迴圈的示意圖。(1) 在 94-96 °C 下變性。(2) 在約 65 °C 下退火。(3) 在 72 °C 下延伸。這裡顯示了四個迴圈。藍色線代表 DNA 模板，引物（紅色箭頭）與之退火，並被 DNA 聚合酶（淺綠色圓圈）延伸，以產生較短的 DNA 產物（綠色線），這些產物本身在 PCR 過程中用作模板。通常，PCR 由一系列 20-40 次重複的溫度變化（稱為迴圈）組成，每個迴圈通常包括 2-3 個離散的溫度步驟，通常是三個步驟。迴圈通常在高溫（>90°C）下進行一個單一溫度步驟（稱為保持）開始，然後在最後進行一個保持，以進行最終產物延伸或短暫儲存。使用的溫度以及它們在每個迴圈中應用的時間取決於各種引數。這些引數包括用於 DNA 合成的酶、反應中二價離子和 dNTP 的濃度以及引物的熔解溫度 (Tm)。初始化步驟：此步驟包括將反應加熱到 94-96 °C（或如果使用極度耐熱聚合酶則為 98 °C），並保持 1-9 分鐘。這僅適用於需要透過熱啟動 PCR 熱啟用的 DNA 聚合酶。變性步驟：這是第一個常規迴圈事件，包括將反應加熱到 94-98 °C 並保持 20-30 秒。它透過破壞互補鹼基之間的氫鍵來導致 DNA 模板變性，從而產生單鏈 DNA 分子。退火步驟：反應溫度降至 50-65 °C 並保持 20-40 秒，允許引物與單鏈 DNA 模板退火。通常，退火溫度比所用引物的 Tm 低約 3-5 攝氏度。只有當引物序列與模板序列非常匹配時，才會形成穩定的 DNA-DNA 氫鍵。聚合酶與引物-模板雜交體結合並開始 DNA 合成。延伸/延長步驟：此步驟的溫度取決於所使用的 DNA 聚合酶；Taq 聚合酶在其最佳活性溫度在 75-80 °C，並且通常使用這種酶時使用 72 °C 的溫度。在此步驟中，DNA 聚合酶透過新增與模板互補的 dNTP 來合成與 DNA 模板鏈互補的新 DNA 鏈，這些 dNTP 在 5' 到 3' 方向上與新合成（延伸）的 DNA 鏈末端的 3'-羥基縮合。延伸時間取決於所使用的 DNA 聚合酶和待擴增的 DNA 片段的長度。作為經驗法則，在其最佳溫度下，DNA 聚合酶每分鐘會聚合一千個鹼基。在最佳條件下，即如果沒有由於限制性底物或試劑造成的限制，則在每個延伸步驟中，DNA 目標的量都會翻倍，從而導致特定 DNA 片段的指數（幾何）擴增。最終延伸：此單一步驟偶爾在最後一個 PCR 迴圈後在 70-74 °C 下進行 5-15 分鐘，以確保任何剩餘的單鏈 DNA 完全延伸。最終保持：此步驟在 4-15 °C 下進行無限時間，可用於短時間儲存反應。

為了檢查 PCR 是否產生了預期的 DNA 片段（有時也稱為擴增子或擴增子），採用瓊脂糖凝膠電泳來分離 PCR 產物的尺寸。透過與 DNA 梯子（分子量標記）進行比較來確定 PCR 產物的尺寸，DNA 梯子包含已知尺寸的 DNA 片段，與 PCR 產物一起在凝膠上執行。