蛋白質組學/生物標誌物
簡報
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主要重點
本文的主要重點是回顧了使用質譜定量蛋白質的方法和應用，特別是那些濃度低於 µg/ml 的蛋白質，試圖使程式普遍化。
新術語
- MALDI TOF/TOF
- 基質輔助雷射解吸/電離飛行時間串聯質譜儀。
- 選擇反應監測 (SRM)
- 一種方法，其中檢測來自特定母離子的特定產物離子。所有其他質量不在預定範圍內指定的離子都被濾除，只留下質量在我們要尋找的範圍內的離子。（來源 http://en.wikipedia.org/wiki/Mass_chromatogram#Selected_reaction_monitoring_.28SRM.29）
- 三重四極杆
- 一種包含三個四極杆線性序列的 MS 型別。第一組和第三組充當質量過濾器，第二組是碰撞池。這種型別的 MS 可以“過濾”已知質量的離子。（來源 http://en.wikipedia.org/wiki/Quadrupole_mass_analyzer）
- 醯肼
- 一類有機化合物，它們共享一個共同的官能團，其特徵在於 N-N 共價鍵，其中一個成分是醯基。（來源 http://en.wikipedia.org/wiki/Hydrazide）
- 生物標誌物
- 可以用來衡量治療或疾病影響進展的生化特徵。（來源 http://www.medterms.com/script/main/art.asp?articlekey=6685）
對於本摘要，我們將重點關注蛋白質生物標誌物。一些具有顯示出作為篩選工具前景的蛋白質生物標誌物的疾病是乳腺癌、阿爾茨海默病、白血病、ALS 和帕金森病[1]。為了成功驗證一種或一組生物標誌物，必須完成六個步驟：發現、鑑定、驗證、測定最佳化、驗證和商業化[2]。一旦找到並接受生物標誌物，就可以將其用於預測和預防與之相關的疾病。以下摘要重點介紹了尋找和識別蛋白質生物標誌物中蛋白質定量的方法。透過找到普遍定量蛋白質的方法，可以進行一次篩選而不是多次篩選來尋找所有生物標誌物，一旦確定了結論性的生物標誌物。
總結
隨著技術的最新突破，可以想象，可以使用一種“通用”方法或方法，對大量的蛋白質進行定量分析，以尋找潛在的生物標誌物，而幾乎沒有限制。一旦發現了幾個潛在的生物標誌物，就可以進行進一步的研究來確認或反駁其在臨床應用中的使用。另一個目標是輕鬆地在一個測量中積累多個檢測。透過識別合成穩定同位素連線到其相應的蛋白質或肽上，進行測量。每種同位素都模擬肽的內源性對應物，從而實現高選擇性。
質譜 (MS) 為我們提供了一個強大的工具來比較兩種不同的蛋白質樣本。它可以用於在全球範圍內比較患病樣本與正常樣本的蛋白質組。這適用於各種人類疾病，希望它能導致識別生物標誌物甚至疾病的發病機制。傳統上，ELISA（酶聯免疫吸附測定）一直是具有良好靈敏度的蛋白質定量的主要方法。即使在今天，它仍然是靶向蛋白質定量的“金標準”。ELISA 的主要缺點是缺乏高特異性抗體。
大約 20 年前，使用穩定同位素稀釋法和 MS 首次嘗試確定特定蛋白質的量，從原子轟擊 MS 和氘標記的合成多肽開始。MS 儀器的進步提高了我們在複雜生物樣本中檢測候選蛋白質的能力，並具有很高的靈敏度。為了量化結果，將穩定同位素（例如，含有13C 或15N）引入參考肽序列中的選定氨基酸，提供具有相同理化性質的肽，可以透過 MS 與靶組織或液體中的肽輕鬆區分。研究表明，含有穩定同位素的全長蛋白質可用於定量尿液和水樣品中的生物標誌物，靈敏度分別達到納摩爾和皮摩爾水平。
用於定量蛋白質組學的多平臺 MS 平臺，其中一些是三重四極杆（三重 Q）、基質輔助雷射解吸/電離飛行時間串聯質譜儀 (MALDI TOF/TOF)、基於 QTOF MS 的電噴霧電離 (ESI) 和使用選擇性離子監測 (SIM) 模式的離子阱儀器。上述平臺中最受歡迎的是三重 Q。演示表明，它可以在單個測量中多路複用並同時靶向超過 50 種肽以進行血漿定量。對於靶向定量分析，液相色譜與 MALDI 的耦合極大地增強了 MALDI 基質 MS 的效能。這種應用的一些優勢包括能夠並行執行技術，可以將其製成高度選擇性的資料驅動程式，並且在一定程度上保留樣本以進行重複分析。該技術還以其潛在的高通量和出色的解析度而著稱。
定量中最重要的一步之一是樣品製備，這會極大地影響靈敏度。最常用的步驟之一是去除高丰度蛋白，這使得增強分析動態範圍和檢測低濃度蛋白變得更加容易。執行的技術之一是強陽離子交換色譜 (SCX)，該技術已被證明能夠檢測到高 pg/ml 水平的肽，比直接血漿分析提高了 100 倍。
翻譯後修飾 (PTM) 是一種重要的過程，需要理解，因為它通常參與腫瘤進展，但由於糖鏈的複雜性和結構（如糖基化 PTM），很難模擬。一項實驗提取了 N-連線的糖肽並脫糖基化。這導致 Asn 轉換為 Asp 以及質量的差異。利用這一點製作了合成多肽來複制其糖基化形式的 N-連線糖肽。
基於 MS 的定量的主要特點之一是用於識別與疾病相關的生物標誌物的臨床應用。例如，已經提出了 177 種與血漿中中風和心血管疾病相關的蛋白質候選者。一些與中風相關的生物標誌物是 S-100b、B 型神經營養生長因子、馮·維勒布蘭德因子和單核細胞趨化蛋白-1[3]。已經提出了其他生物標誌物來識別類風溼性關節炎和乳腺癌等疾病。
定量蛋白質和肽能力的主要目標之一是用於個性化醫療。隨著技術的進步，我們將能夠創造出能夠在單次測量中輕鬆組裝多個檢測的技術。來自疾病的生物標誌物也可以在單次測定中進行多路複用，使我們有可能診斷多種疾病。理想情況下，單步製備策略是關鍵，可以實現高通量和可能實現自動化流程，減少人工干預的次數和人為錯誤的可能性。
與蛋白質組學課程的相關性
使用質譜定量蛋白質的能力是一個很好的工具，可以比較來自對照樣品和測試樣品的大量蛋白質，以尋找生物標誌物。當檢測到明顯差異時，可以對這些蛋白質進行進一步研究。MS 技術的重大突破使我們能夠普遍地採用定量廣泛蛋白質譜的方法，幾乎沒有限制。它還使我們能夠在每次測量中進行更多檢測。在未來，這些方法可以為個性化醫療鋪平道路，使我們能夠透過檢測來自單一或多種疾病的多種生物標誌物來篩選個人。
參考文獻
[1] 製藥外包決策。SPG 媒體有限公司。 (http://www.pharmaceuticaloutsourcing.com/articles/pod003_014_power3.htm)
[2] Rifai，Nader，Gillette，Michael A. 和 Carr，Steven A. “蛋白質生物標誌物發現和驗證：通往臨床實用性的漫長而不可預測的道路”。自然生物技術 24, 971 - 983 (2006) (http://www.nature.com/nbt/journal/v24/n8/abs/nbt1235.html)
[3] Reynolds，Mark A. 等人。“中風早期生物標誌物”。臨床化學 49 (2003)：1733-1739。印刷。(http://www.clinchem.org/cgi/content/abstract/49/10/1733)