蛋白質組學/實驗方案/植物蛋白質組學關於二維凝膠電泳

二維凝膠電泳 1. 取4個試管，一側用保鮮膜覆蓋。 2. 製備吸管凝膠緩衝液。 3. 在加入兩性電解質前，用手搖晃直到溶解。 4. 用注射器混合均勻。 5. 用注射器將吸管凝膠緩衝液注入玻璃管中。 6. 保持至少6小時。 7. 植物樣品製備 • 取成熟種子。 • 倒入液氮。 • 用研缽和研杵研磨。 • 在使用前將裂解緩衝液加入樣品中，裂解緩衝液在水浴中於1000℃加熱3分鐘。 • 將樣品置於冰上，用Vibra Cells混合。 • 離心沉澱。 • 在70℃下離心20分鐘。 • 取白蛋白和白蛋白標準品（DDW：Bradford = 4:1），即（8000 + 2000）µl。 • 準備2組樣品和1組5 µl用於紫外分光光度計，另一組用於2-DE。 • 製備3個標準樣品（5、10、15 µl）。 • 另一組置於水浴中於1000℃加熱3分鐘。 • 用紫外分光光度計測試濃度。 8. 準備小瓶，並在小瓶中加入10 ml樣品緩衝液。 9. 檢查凝膠並用注射器將其放入小瓶中。 10. 放入搖床中搖晃1小時30分鐘。 11. 去除溶液，再次加入10 µl緩衝液兩次。 12. 製備分離凝膠，倒入並等待40分鐘。 13. 製備積層凝膠，並等待3-4小時。 14. 將機器執行到頂部（H3PO4）和底部（NaOH）。 15. 在去除水之前，將樣品倒入試管中。 16. 啟動機器（第一小時=200 V，第二小時=400 V，接下來的16小時=600 V）。

17. 將一維凝膠置於二維板上。 18. 製備瓊脂糖凝膠。 19. 放置標記和瓊脂糖凝膠。 20. 執行機器（一臺機器80 mA，兩臺機器160 mA），直到結束。 21. 分離凝膠，在製備考馬斯亮藍之前將其浸泡在考馬斯亮藍中。 22. 保持至少12小時。

銀染方案 1. 固定液 40% 乙醇

乙醇 100 ml
冰醋酸 25 ml
水 250 ml

注意：將凝膠浸泡在固定液中30分鐘。 2. 感光液

乙醇 75 ml
硫代硫酸鈉（5% w/v）10 ml
醋酸鈉（17 g）1包
水 250 ml

使用前：新增1.25 ml戊二醛（25% w/v）注意：去除溶液。加入感光液，搖晃至少30分鐘。

洗滌5分鐘。

3. 銀溶液

硝酸銀溶液（2.5% w/v）25 ml
水 250 ml

使用前：新增0.1 ml甲醛（37% w/v）注意：搖晃20分鐘，洗滌1分鐘，重複兩次。 4. 顯影液

碳酸鈉（6.25 g）1包
水 250 ml
劇烈攪拌以溶解碳酸鈉。

注意：搖晃2-5分鐘。 5. 終止液

EDTA-Na¬¬2 .2 H2 O (3.65 g) 1包
水 250 ml

注意：搖晃10分鐘，用雙蒸水洗滌5分鐘，重複三次。 6. 水溶液

雙蒸水

凝膠內消化

1. 在500 µl試管中加入200 µl DDW。 2. 用1 ml藍色吸頭將凝膠從凝膠板上分離。切片凝膠，渦旋5分鐘並去除水。 3. 加入100 µl 25mM ABC/50% ACN，然後渦旋10分鐘，離心沉澱並去除溶液。重複4-5次。

1. 過度染色，直到變成白色，持續30分鐘。

4. 放入真空濃縮儀中。 5. 加入50 µl mM DTT/25 mM，然後在水浴中於56℃加熱45分鐘，然後離心沉澱並去除溶液。 6. 加入50 µl mM IAA/0.1% ABC，並在黑暗處放置30分鐘。 7. 不要離心沉澱，去除溶液。 8. 加入50 µl 0.1M ABC，渦旋5分鐘並去除溶液。 9. 加入50 µl 100% ACN，渦旋15分鐘並去除溶液。 10. 放入真空濃縮儀中30分鐘。 11. 加入25 µl胰蛋白酶（0.1 µg/µl），在4℃冰箱中放置45分鐘。 12. 加入35-40 µl 25mM ABC（pH 8.0），在水浴中於37℃孵育過夜，然後離心沉澱，提取胰蛋白酶。 13. 製備ACN/DDW/TFA (660:330:10) µl。 14. 在樣品中加入50 µl (ACN/DDW/TFA)，放置30分鐘並過度染色，重複此步驟，離心沉澱，提取溶液並儲存。重複此步驟。 15. 放入真空濃縮儀中2小時，直到樣品體積為10-20 µl。

MALDI-TOF/MS 分光光度計

1. 在凝膠塊中加入5%甲酸（考馬斯亮藍為10 µl，銀染為5 µl），然後用移液器移取。 2. 渦旋並離心沉澱。 3. 製備溶液A：0.1% TFA，溶液B：70% ACN，0.03% TFA，基質溶液：（0.1% TFA 500µl + 50% ACN 500µl + CHCA 10 mg）。 4. 使用C18吸頭，用溶液B：70% ACN，0.03% TFA沖洗Zip Tip（5-10次）。 5. 使用C18吸頭，用溶液A：0.1% TFA沖洗Zip Tip（5-10次）。 6. 將樣品在Zip Tip中上下移動（10次）。 7. 用溶液A：0.1% TFA脫鹽。 8. 將基質溶液（5-10 µl）放置在MALDI板上。 9. 乾燥後，加入溶液A：0.1% TFA並去除。 10. 加入DDW並去除。

提交者：Abu Hena Mostafa Kamal，博士生，植物蛋白質組學實驗室，作物科學系，農業學院，忠北國立大學，清州，361-763，韓國