蛋白質組學/蛋白質一級結構/測序方法
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蛋白質測序指的是確定蛋白質的氨基酸序列或一級結構的過程。測序在蛋白質組學中起著至關重要的作用，因為獲得的資訊可用於推斷功能、結構和位置，進而有助於識別新的或新穎的蛋白質以及理解細胞過程。更好地理解這些過程有助於創造靶向特定代謝途徑等藥物。
儘管存在幾種測序蛋白質的方法，但兩種主要方法是質譜法和Edman降解。其他不常用但仍然可以發揮非常特定作用的方法，例如克服不足或作為補充兩種主要方法的初步步驟。
蛋白質測序的出現可以追溯到弗雷德里克·桑格和佩爾·埃德曼幾乎同時做出的兩項發現。
佩爾·埃德曼於1947年開始在洛克菲勒醫學研究所普林斯頓分部的諾斯羅普-庫尼茨實驗室工作，在那裡他試圖找到一種使用化學物質解碼蛋白質氨基酸序列的方法；具體來說，他早期使用氟二硝基苯（FDNB）和苯異硫氰酸酯（PITC）取得了成功。在普林斯頓的一年裡，埃德曼能夠進行足夠的實驗來理解使用FDNB和PITC等試劑確定氨基酸序列是可行的。埃德曼於1947年返回瑞典，並在經過兩年的工作後，他發表了他的論文，該論文描述了第一種成功測序蛋白質的方法[1]。這篇開創性的論文描述了一種確定蛋白質氨基酸序列的方法，並最終被稱為Edman降解。
五年前，弗雷德里克·桑格已經證明了一種使用試劑氟二硝基苯確定多肽鏈N端氨基酸殘基的方法。雖然人們認為這種方法最多隻能提供N端發現的序列，但桑格能夠將這種方法更進一步。透過使用幾種蛋白水解酶、部分水解和早期的色譜方法，桑格能夠將蛋白質裂解成片段並將殘基像拼圖一樣拼湊起來。直到1955年，桑格才能夠展示胰島素的完整序列，這使他於1958年獲得了諾貝爾化學獎。
質譜法作為分析單個分子的工具，在桑格或埃德曼開始蛋白質測序工作之前就已經存在了許多年。從19世紀末的早期開始，它的硬體和軟體都發生了許多變化，並且已被證明對測序領域至關重要，因此有更多諾貝爾獎頒發給了能夠改進這項技術的人。儘管它在今天很重要，但直到1966年，K. Biemann、C. Cone、B.R. Webster和G.P. Arsenault測序了幾個包含甘氨酸、丙氨酸、絲氨酸、脯氨酸和幾個其他氨基酸的寡肽[2]，質譜法的意義才被充分認識。20世紀80年代後期出現了進一步的發展，質譜儀成為實驗室中更強大的儀器。1989年首次展示了快速原子轟擊電離與串聯質譜聯用在蛋白質序列鑑定中的應用。這項工作是20世紀90年代初開始使用的蛋白質質量指紋圖譜程式的早期基礎。隨著MALDI和電噴霧電離作為兩種新的電離方法的出現，質譜法的動態範圍得到了極大的改善，為質譜儀成為蛋白質測序中的主要工具鋪平了道路。1996年蛋白質組學的出現見證了許多快速發展，如計算能力的提高、全球資訊網和蛋白質資料庫的發展以及質譜多四極杆系統的發展，使MALDI-MS/MS和其他串聯質譜法成為可能[3]。
N端殘基鑑定包括一種化學確定哪個氨基酸形成肽鏈的N端的技術。此資訊可用於幫助排序使用其他測序技術生成的單個肽序列，這些技術會使肽鏈斷裂。通常，第一輪Edman降解還將包含可能使N端殘基鑑定變得困難的雜質。下面描述了N端殘基鑑定的通用過程[4]
- 使用將選擇性標記末端氨基酸的試劑標記遊離的未質子化的α-氨基。可以實現此目的的試劑包括2,4-二硝基氟苯（DFNB - Sanger試劑）、丹醯氯和苯異硫氰酸酯（Edman試劑）。
- 用酸水解標記的肽，產生N端殘基和其他遊離氨基酸。
- 可以使用色譜法分離和鑑定每個這些衍生的N端殘基。
這些方法可用於鑑定肽的N端殘基。這是一個耗時的過程，現在效率更高的測序技術可用，因此其用途有所減少。使問題進一步複雜化的是：過程中使用的某些試劑還可以降解氨基酸殘基，直至它們無法識別。在可用於標記N端殘基的試劑中，由於其高熒光性質，丹醯氯比FDNB靈敏約100倍，這使其在微量情況下易於檢測。Edman試劑的使用也是有利的，因為它使肽鏈中剩餘的殘基不受影響，如下一節所述。
Edman降解方法基於以下原理：單個氨基酸殘基可以被化學修飾，以便在不破壞任何其他殘基之間鍵的情況下從鏈上裂解[5]。該程式可以使用非常少量的肽來實現，通常大約10-100皮摩爾的量將允許成功完成。樣品必須只包含一種蛋白質成分，並且應不含任何干擾降解過程的試劑，例如甘氨酸、甘油、蔗糖、胍、乙醇胺、硫酸銨和銨鹽。下面描述了通用方法[6][7]
- 要測序的肽首先必須透過吸收到化學修飾的玻璃上或透過電印跡到多孔聚偏二氟乙烯（PVDF）膜上進行固定。
- 在弱鹼性條件下，苯異硫氰酸酯（PITC）與氨基酸鏈上的未帶電荷的末端基團反應，形成苯硫氨基甲醯衍生物。
- 然後，使用三氟乙酸裂解該苯硫代氨甲醯衍生物，生成其苯胺基噻唑啉酮衍生物（ATZ-氨基酸）。下一個末端氨基酸現在暴露出來，並準備好發生相同的反應。
- 進行洗滌以去除多餘的緩衝液和試劑，並用乙酸乙酯選擇性地提取ATZ氨基酸，並將其轉化為更穩定的苯硫代腙（PTH）-氨基酸衍生物。
- 使用色譜法或電泳法鑑定PTH氨基酸衍生物。
- 現在可以對鏈的其餘殘基重複此過程。
Edman降解程式的自動化始於1967年[8]，並且由於其靈敏度和快速完成而繼續成為一種有利的測序方法。可以自動化Edman降解程式的測序儀包括Applied Biosystems Procise或Protein Sequencer系列的許多型號。
該程式的主要缺點仍然是肽鏈的長度。如果鏈的長度超過50-60個殘基（實際上為30個殘基），則由於迴圈衍生化的不完整，該程式往往會失敗。這可以透過獲取較大的肽鏈並使用氰化溴、胰蛋白酶、糜蛋白酶或任何可以斷裂肽鏈的酶/化學物質將其裂解成較小的片段來解決。
由於其易於自動化和極高的準確性，質譜法正迅速成為識別蛋白質序列的金標準。現在，使用質譜法測序蛋白質的過程占主導地位。使用質譜法識別蛋白質序列的兩種最流行的方法是
1. 肽質量指紋圖譜 2. 串聯質譜法
這種方法也稱為蛋白質指紋圖譜，由幾個小組於1993年開發。將未知蛋白質裂解成較小的片段，以便可以使用質譜儀準確測量這些較小的片段。下面顯示了廣義程式：1. 蛋白質樣品被蛋白水解酶分解成幾個較小的肽片段。2. 使用乙腈提取所得片段，並透過真空乾燥。然後將肽溶解在蒸餾水中，準備進行分析。3. 然後將肽插入質譜儀（如ESI-TOF）的真空室中。質譜儀生成一個峰列表（即分子量的列表），然後將其與SwissProt或GeneBank等資料庫進行比較以查詢匹配項。軟體用於將檢索到的基因組資料翻譯成蛋白質，然後透過與用於裂解未知蛋白質相同的酶進行模擬裂解。計算這些片段的質量，然後與未知蛋白質的質量進行比較。
串聯質譜法描述了將質譜法劃分為單獨步驟的過程，其中這些步驟之間發生碎片化。這些分離可以透過空間中的物理分離（透過稱為四極杆的單獨腔室）、使用多個質譜儀或透過單個質譜儀的時間來實現。下面描述了廣義程式，1. 目標蛋白的酶促或化學降解以產生肽。2. 透過高效液相色譜分離肽。3. 將所得片段送入質譜儀進行分析。
串聯質譜法的片段分析發生在兩個或多個四極杆系統中，第一個四極杆過濾選擇將進行進一步分析的離子。這些過濾後的離子被轉移到第二個四極杆，第二個四極杆充當碰撞中心，以在醯胺鍵處誘導進一步的片段化。然後使用第三個四極杆按質量分離這些片段。串聯質譜法主要產生N-端和C-端型別的肽，這些肽透過質量/電荷與強度圖在二維上表示。質譜儀產生的包含所有片段分子量的譜圖稱為肽圖，可以作為識別質譜儀分析的蛋白質的一種手段。識別蛋白質序列的其他方法包括蛋白質序列標籤和從頭方法。
- ↑ Morgan, F.J. "AAS傳記回憶錄 - Pehr Victor Edman 1916 - 1977。" 1998年4月8日。墨爾本大學。2008年3月30日訪問。<http://www.asap.unimelb.edu.au/bsparcs/aasmemoirs/edman.htm>。
- ↑ Biemann K., Cone C., Webster B.R., Arsenault G.P. 透過計算機解釋其高解析度質譜確定寡肽中的氨基酸序列 J. Am. Chem. Soc.，1966，88（23），第5598-606頁。PMID：5980176。線上提供全文。
- ↑ Henzel W.J.，Watanabe C.，Stults J.T. 蛋白質鑑定：肽質量指紋圖譜的起源。美國質譜學會雜誌，2003，14（），第931頁 線上提供全文
- ↑ Bhagavan，N. V.（2001）醫學生物化學（Harcourt Academic，聖地亞哥）。線上提供全文
- ↑ http://en.wikipedia.org/wiki/Edman_degradation
- ↑ Lottspeich，Friedrich。“Edman測序。”馬克斯·普朗克生物化學研究所。2008年3月30日訪問。<http://wwwa2.udic.org/en/rg/lottspeich/technologies/edman_sequenzing/absatz_2_edman_degradation.pdf>。
- ↑ Edwards，Adam。“亞當·愛德華茲的蛋白質測序。” 1999年12月6日。山福德大學。2008年3月30日訪問。<http://faculty.samford.edu/~gekeller/edwards.html>。
- ↑ 自動Edman降解：蛋白質測序儀。 Methods Enzymol. 1973，27，942-1010。