蛋白質組學/蛋白質樣品製備/蛋白質處理和儲存
隨著時間的推移，蛋白質結構會發生變化，這可能會改變實驗結果。蛋白質處理不當也會導致許多問題。樣品中的汙染物會導致結果出現偏差，甚至會損壞裝置。然而，在蛋白質處理和儲存過程中，可以採取許多措施來最大限度地減少任何損壞，從而最大限度地提高結果的準確性。
在處理蛋白質樣品時，戴上手套非常重要。通常，戴上手套是為了保護我們在處理有害物質時，但手套也用來保護樣品不受我們手上任何外來蛋白質或化學物質的影響。汙染不僅會導致意外結果，還會損害我們的樣品。出於同樣的原因，使用無菌容器、移液器吸頭等也至關重要。
在某些情況下，可能希望儲存蛋白質以便在幾個月後使用；最常見的是透過冷凍實現。透過將蛋白質儲存在-20攝氏度以下的溫度，可以儲存分子的結構成分，直到使用為止，確保其功能。然而，如果冷凍過程沒有正確進行，蛋白質實際上會發生 pH 值和鹽濃度急劇變化。為了避免隨著時間的推移而發生這些環境變化，可以將樣品“快速冷凍”，方法是將裝有蛋白質樣品的試管浸入乾冰、乙醇和丙酮的混合物中。冷凍後，可以將樣品迅速在水杯中解凍。
在進行任何蛋白質組學實驗時，必須注意樣品中蛋白質或肽可能因其化學性質而造成的損失。例如，疏水性蛋白質在溶液中粘附到試管或色譜柱壁的情況並不少見。如果已知目標蛋白質是疏水性的，則可以使用 **矽烷化** 的玻璃器皿或購買矽烷化玻璃器皿，以防止蛋白質損失。
微型活檢、雷射捕獲顯微切割和幹細胞治療只能提供少量非傳統樣本，為了利用這些微小樣本，需要一種更少的浪費樣品製備方法。三氟乙醇為此提供了一種可行的替代方案。
壓力迴圈技術 (PCT) 在反應容器中交替壓力。例如，將樣品放入一個密閉的容器中，然後將容器中的壓力在極高壓力和室壓之間交替變化。當壓力從極高下降到室壓時，可壓縮分子（如脂質）往往會解離。一個有用的解離例子是雙層脂質膜的解離，這會導致蛋白質和其他代謝物從雙層脂質層中釋放出來。
PCT 輔助液液萃取 [1] 利用 PCT 將樣品分離成不同的類別，在同一個反應容器中使用類別特異性不混溶溶劑。將初始溶劑與原始樣品混合，然後提高壓力。隨著壓力的峰值，溶劑混合，形成臨時溶劑，樣品溶解在這個新的臨時溶劑中。降低壓力，臨時溶劑重新分離成初始溶劑，在此過程中分離溶解的樣品（不同類別的樣品分子在特定的初始溶劑中溶解度更高）。在室壓下，每類樣品分子在每個初始不混溶溶劑中被發現分離。
主要重點
使用有機共溶劑 (TFE) 代替傳統洗滌劑可以最大限度地減少樣品損失。
摘要
微型活檢、雷射捕獲顯微切割和幹細胞治療只能提供少量非傳統樣本，為了利用這些微小樣本，需要一種更少的浪費樣品製備方法。
蛋白質組學樣品處理的典型方案通常涉及使用強變性劑，如尿素或鹽酸胍，以及不同型別的洗滌劑。這些方法速度很快，然而，在進行 LC-MS 分析之前，需要從樣品中完全去除洗滌劑或鹽。如果未正確去除，檢測靈敏度水平可能不足以檢測肽。當處理小於微克的樣品大小時，這些程式顯示出其缺點，因為在去除洗滌劑時，不可避免地會留下一些樣品。
為了解決使用去汙劑帶來的問題，我們採用了一種僅需單管的樣本製備技術。該技術使用三氟乙醇（TFE）代替去汙劑，並將其溶解在低滲水溶液緩衝液中。TFE 更優越，因為它可以提高蛋白質的溶解度和變性，並且易於蒸發，因此在不再需要 TFE 時無需將其移除。因此，使用 TFE 代替去汙劑可以省去清理步驟，從而避免了去除去汙劑產生的廢物。
我們使用兩種不同的老鼠腦組織樣本進行實驗以驗證該假設。一個樣本在變性劑和 CHAPS 緩衝液中被破壞，而另一個樣本在含有 50% TFE 的低滲緩衝液中被破壞。兩種樣本的色譜圖表明，第一個樣本中去汙劑的存在抑制了與去汙劑共洗脫的肽段的訊號。使用 TFE 協議比使用 CHAPS 協議識別出更多的蛋白質。此外，即使在處理後的 MCF 細胞中，TFE 也被證明比傳統的基於去汙劑的協議更有效，識別出的蛋白質數量比使用傳統方法更多。
基於 TFE 的協議在微型和奈米級樣本處理方面被證明比傳統方法更有效。使用基於 TFE 的協議的主要優勢是消除了額外的清理步驟，整個過程都在一個試管中進行，因此無需手動操作，也不會造成樣本損失。TFE 的其他優點包括提高蛋白質溶解度，增強蛋白質變性，最後它可以透過胰蛋白酶消化去除，無需進行任何額外的清理步驟。基於 TFE 的協議還提供了更好的樣本回收率和更好的重現性。
新術語
- 有機溶劑
- 一種通常為液態的化學化合物，含有碳，可以溶解另一種物質（溶質）。(http://www.knowledgebank.irri.org/glossary/Glossary/O.htm)
- 三氟乙醇
- 化學式為 CF3CH2OH 的有機化合物。也稱為 TFE 或三氟乙基醇，這種無色、可與水混溶的液體具有類似於乙醇的氣味。(http://en.wikipedia.org/wiki/Trifluoroethanol)
- 液相色譜
- 一種基於樣品化合物在固定相和液體流動相之間的分配的色譜分離方法。(http://www.nhml.com/resources_NHML_Definitions.cfm)
- 固相萃取
- 一種分離過程，用於根據物質的物理和化學性質從混合物中去除某些化合物。(http://en.wikipedia.org/wiki/Solid_phase_extraction)
- 兩性離子
- 一種總淨電荷為 0 的化學化合物，因此呈電中性，但其不同原子帶有形式上的正負電荷。(http://en.wikipedia.org/wiki/Zwitterionic)
- 體素化
- 對大腦基因表達進行多體積影像的高通量採集。(http://labs.pharmacology.ucla.edu/smithlab/publications_files/pdf/Singh_JNM_2003.pdf)
課程相關性
在嘗試檢測蛋白質組中不同蛋白質時，樣本製備效率可能是一個大問題，因為如果蛋白質組一開始只含有少量特定蛋白質，那麼在製備過程中樣本的任何損失都可能意味著部分或全部蛋白質的損失。因此，學習各種不同的樣本製備方法，特別是最高效的方法，對於希望處理和製備蛋白質組樣本的學生來說非常有用。
基於靜水壓迴圈技術的組織分餾：用於系統生物學研究的統一樣本製備技術
[edit | edit source]主要重點
作者提出了一種新型的、無去汙劑的、同時取樣過程，該過程利用壓力迴圈技術 (PCT) 作為新過程的基礎，從同一樣本中高效提取多種生物分子類別。新過程的一大優勢是，樣本可以直接用於另一個（相容的）過程進行進一步分析（如質譜），或者在進一步分析之前僅需進行最小的清理。強調了其與系統生物學研究的相關性。[2]
摘要
鑑於系統生物學研究的日益普及，提高分析樣本的一致性和質量變得越來越重要。許多當前的高質量取樣技術都針對單一型別的分析（DNA/RNA、蛋白質或脂質）。同時取樣技術很重要，特別是在系統生物學研究中，因為分析過程中必須將來自多個分子類別的資訊進行關聯。在樣本量很小的情況下（例如，人體活檢組織），同時取樣技術也是至關重要的。
作者開發了一種新的同時取樣協議，該協議使用無去汙劑的過程，將 DNA、RNA、蛋白質和脂質 cleanly 分開。新協議利用壓力迴圈技術 (PCT) 以及一套專有的分配試劑，根據類別分離分子。PCT 透過快速改變壓力，從高壓到低壓，使分子相互作用不穩定。高壓主要影響可壓縮的分子（脂質），隨後在壓力降低時解離。PCT 不會影響共價鍵，因此 DNA、RNA 和蛋白質保持完整，而脂質雙層被拆解。
PCT 輔助液液萃取是另一種基於 PCT 的技術，用於在給定一組分配溶劑的情況下分配樣本。例如，將兩種互不相溶的溶劑與樣本混合。然後提高壓力，溶劑開始融合。當壓力足夠高時，溶劑混合並形成一種臨時的三元溶劑，其中樣本溶解。然後降低壓力，三元溶劑分離回最初的兩種溶劑，原始樣本的顆粒被分配到兩種溶劑中的任一種。當壓力恢復到“正常”時，原始樣本已 cleanly 分配到不同的溶劑相中。在之前的工作中，作者已發展了上述基於 PCT 的技術，並取得了一些商業上的成功。新開發的 ProteoSolve-SB 協議在此基礎上進行了改進，因此新協議能夠從單個樣本中 cleanly 分離 DNA、RNA、蛋白質和脂質。
將 ProteoSolve-SB 與當前的協議進行比較，包括 Thizol、AllPrep 和 PARIS。Thizol 顯示出良好的 DNA 回收率，但存在從有機相緩慢提取和清理的缺點，以及可能發生蛋白質修飾的缺點。Thizol 適用於相對較低的樣本濃度（小於體積的 10%），而 ProteoSolve-SB 相容高達 25% 至 30% 的總樣本濃度。樣本濃度是一個重要因素，因為後續的沉澱過程在樣本濃度更高時效率更高。
AllPrep 的 RNA 回收率體積與 Thizol 和 ProteoSolve-SB 相似，但是它是一個更昂貴的過程，並且測試程式需要多個柱子。AllPrep 還存在潛在蛋白質損失的副作用：許多蛋白質可能不會從 RNA 上解離，因此可能無法回收。此外，回收的蛋白質必須在 SDS-PAGE 之前進行清理；清理過程可能會導致額外的蛋白質損失。
PARIS 回收的 RNA 比其他測試協議少一半，這是預期的，因為只有一半的樣本用於 RNA 分析：另一半用於蛋白質分析。除了 RNA 收率低之外，回收的蛋白質還需要額外的清理（透析、過濾）。
ProteoSolve-SB 已被證明可以產生高 DNA、RNA 收率，以及大量的蛋白質回收率和簡化的脂質回收率（步驟少於其他方法，動手時間更少）。透過 PCT 進行樣本均質化可以產生更一致的樣本，而不是超聲處理或在液氮中研磨。離心後，分析只需進行最小的清理：蛋白質在乾燥後即可使用；脂質可直接用於 MALDI-TOF 質譜分析；DNA、RNA 可以使用常見且相容的提取協議從固相中提取。未來的工作將集中在進一步縮小該過程的規模，以便用於針頭活檢以及來自單個幹細胞的細胞培養。
新術語
- 活檢
- 從活體中移除並檢查組織樣本，用於診斷目的。[3]
- 透析
- 利用溶液中物質在半透膜上的不等擴散進行分離。[4]
- 靜水壓
- 與靜止的流體或流體施加或傳遞的壓力有關。[5]
- 超聲處理
- 透過高頻聲波破壞細胞或 DNA 分子。也稱為超聲波處理。[6]
- 系統生物學
- 一個研究生物系統各個部分（代謝途徑、細胞器、細胞和生物體）之間的關係和相互作用，並整合這些資訊以瞭解生物系統功能的領域。 [7]
課程相關性
這種新方法可提供低蛋白質損失率，並且避免使用可能在蛋白質被進一步分析之前改變蛋白質的去汙劑和其他溶劑。它與蛋白質組學相關，因為它提供了一種從細胞組織中提取蛋白質的另一種方法，以減少原始樣品中蛋白質的損失和/或汙染。對於獨特的或難以獲得的樣品，它也是一個相關的方法。
蛋白質去汙劑清理：一種氣相色譜法用於定量膜蛋白結構研究中常用的去汙劑
氣相色譜法 http://www.separationsnow.com/coi/cda/detail.cda?chId=3&id=20260&type=Feature&page=1/ (2009-01-26)
主要焦點 蛋白質提取的傳統方法涉及使用去汙劑。雖然它們會影響蛋白質的穩定性，但在人們瞭解有機溶劑的優點之前，它們在提取中使用了很長時間。
摘要
蛋白質的結構在不同的功能環境中進行研究，條件與正常條件不同。最常用的方法是在蛋白質的提取、純化、濃縮和結晶中使用去汙劑。但是，去汙劑的濃度對蛋白質的穩定性有很大影響。使用四種去汙劑癸基麥芽糖苷、十二烷基麥芽糖苷、十二烷基磷酸膽鹼和月桂基二甲胺基 N-氧化物說明了測量與蛋白質相關的去汙劑量的過程。去汙劑的分離是在 200-280C 的溫度梯度和 1 微升的低進樣量下進行的。所有這四種去汙劑的保留時間適合於分離和鑑定去汙劑混合物。在實驗條件下進行了分離，得到的校準曲線與二次迴歸曲線相匹配。因此，這是從蛋白質中分離去汙劑混合物最簡單的方法之一。
新術語
- 兩親性
- 包含極性和非極性部分的分子。（http://www.biology-online.org/dictionary/Amphipathic）
- 二次迴歸
- 它是一個過程，在這個過程中，為一組資料找到最佳擬合拋物線的方程。（http://calculator.maconstate.edu/quad_regression/index.html）
- Centricon 過濾
- Centricon 過濾裝置透過超濾提供快速高效的生物大分子濃縮和脫鹽。（http://www.millipore.com/userguides/tech1/p99259）
- 洗脫緩衝液
- 洗脫緩衝液用於洗去先前實驗中殘留的任何蛋白質。（http://wiki.answers.com/Q/What_is_an_elution_buffer）
- 氣相色譜法
- 一種方法，透過將樣品汽化成載氣流並將氣體透過含有選擇性保留（吸收）和釋放揮發性成分的物質的色譜柱來分離混合物的成分。（http://www.biotechmedia.com/definitions-g.html）
課程相關性
基於去汙劑的提取用於提取蛋白質。其中最先進的方法是使用有機溶劑提取蛋白質，通常不需要分離，它們會蒸發。
壓力迴圈技術 (PCT)：一種針對富含脂質樣品的新型生物標誌物發現和藥物開發樣品製備方法
主要重點
PCT 將透過為從業人員提供一種安全高效地將生物樣品分餾成特定生物類別（蛋白質、脂質）的技術來提高基於蛋白質組學的研究所需的發現率，在某些情況下（尤其是對於蛋白質），這些技術可以直接輸入常見的下游分析過程。
摘要
美國的主要疾病仍然是生物學研究的目標：即肥胖、心臟病和糖尿病。[8] 這些疾病之間的關係以及生物學機制的分析都非常複雜。需要改進的過程和技術來對抗這些疾病，特別重要的是更有效的藥物發現和藥物開發週期。此類改進將越來越多地支援複雜的科研工作，包括利用生物標誌物和蛋白質組學推動發現前進。
在蛋白質組學領域，存在一些需要解決的重要技術挑戰，包括對更低蛋白質濃度的過程的需求，以及在組織蛋白質組學中，感興趣的蛋白質主要存在於脂質中。樣品製備技術在蛋白質組學實驗的結果中起著重要作用，目前許多製備技術存在安全、汙染、加工時間長且不易自動化的缺點。使問題更加複雜的是，有些技術只適用於特定的樣品型別。結果，實驗結果不容易、可靠地複製。
在高脂濃度組織中發現的蛋白質對於我們理解重要疾病至關重要。使用去汙劑帶來了挑戰，因為樣品中並非所有蛋白質都可能暴露出來，尤其是當脂質濃度超過 60% 且樣品在水溶液中製備時。此外，去汙劑並不總是與後續分析程式相容。在某些情況下，感興趣的蛋白質還與細胞碎片一起被丟棄。這些型別的挑戰會對研究的步伐產生負面影響。
壓力迴圈技術 (PCT) 解決了上述問題。在單一步驟中，使用所有有機（非基於去汙劑）溶劑，脂質和蛋白質以對研究人員非常安全的方式解離和分配。基於 PCT 的液-液萃取用於捕獲不同溶劑餾分中的解離分子。將樣品新增到不互溶溶劑的混合物中。接下來，PCT 利用反應容器中的高壓來分解和混合樣品與液體溶劑。在高壓釋放後，樣品分子在初始液體溶劑中被分餾。PCT 中的反應容器（特殊反應管）設計用於承受高壓，將樣品和溶劑與汙染物隔離，併為研究人員提供安全性。PCT 在將蛋白質從脂質組織中釋放出來方面特別有效。
在一項壓力生物科學公司和哈佛大學公共衛生學院之間的研究中，對脂肪組織的蛋白質組學分析結果被認為對糖尿病和肥胖的機制研究有用。在這項研究的結果中，據報道 PCT 與更“傳統”的技術相比具有更高的蛋白質產量。PCT 結果產量高且易於獲得。PCT 也與下游蛋白質鑑定方法 (HPLC-ES/MS) 相容。PCT 過程也高度可重複。
其他應用可能包括那些處理神經系統疾病的應用，例如阿爾茨海默病、帕金森病、多發性硬化症、多動症、抑鬱症和/或精神分裂症。神經系統疾病是一個有趣的研究目標，因為髓鞘（覆蓋神經元細胞的大部分）的蛋白質/脂質比率約為 3 比 7。磷脂傾向於成為膜蛋白，對神經元調節很重要 - 因此，磷脂也是一個有趣的研究目標。
新術語
- 脂肪細胞
- 專門用於合成和儲存脂肪的動物結締組織細胞。這些細胞被甘油三酯小球膨脹。[9]
- 生物標誌物
- 可用於測量疾病進展或治療效果的生化特徵或方面。[10]
- 空化
- 在承受快速劇烈壓力變化的液體中形成和瞬時坍塌無數微小空隙或空洞。超聲輻射產生的空化有時用於進行劇烈的區域性攪拌。由劇烈湍流引起的空化通常會導致空化損傷。[11]
- 脫脂
- 去除脂質或脂質基團，通常是從蛋白質中去除。[12]
- 不互溶
- 不能混合而不分離相。水和石油在大多數情況下是不互溶的，儘管它們可以透過新增乳化劑而變得互溶。[13]
課程相關性
PCT 與蛋白質組學相關，因為它是一種高效、安全、自動化、可重複的樣品製備技術的基礎，在從脂質組織中提取蛋白質方面尤其重要。
- ^ Gross V, Carlson G, Kwan AT, Smejkal G, Freeman E, Ivanov AR, Lazarev A. Journal of Biomolecular Techniques 19:189-199 (2008)
- ^ Pressure Biosciences http://www.ngpharma.com/article/Issue-9/Drug-Discovery/Pressure-Cycling-Technology-PCT-a-Novel-Sample---Preparation-Approach-to-Biomarker-Discovery-and-Drug-Development-in-Lipid-Rich-Samples/ (2009-03-24)
- ^ Steve Down
- ^ 系統生物學 來自 http://publications.nigms.nih.gov/thenewgenetics/glossary.html#S
- ^ 超聲處理 來自 http://www.fao.org/docrep/003/x3910e/X3910E22.htm
- ^ 透析 來自 http://wordnetweb.princeton.edu/perl/webwn?s=dialysis
- ^ 流體靜力學 來自 http://www.merriam-webster.com/dictionary/hydrostatic
- ^ 活檢 來自 http://en.wiktionary.org/wiki/biopsy
- ^ 生物標誌物 來自 http://www.medicinenet.com/parkinsons_disease/glossary.htm
- ^ 空化 來自 http://www.hghouston.com/c.html
- ^ 脂肪細胞 來自 http://www.bcerc.org/glossary.htm
- ^ 脫脂 來自 http://en.wiktionary.org/wiki/delipidation
- ^ 不混溶 來自 http://www.pneumatic-source.com/resources/glossary/i.shtml
Jörg von Hagen, VCH-Wiley 2008 蛋白質組學樣品製備。 ISBN 978-3-527-31796-7