大多數敵人可以透過踩踏、火球或浣熊尾巴的揮舞來消滅。雖然火球和尾巴攻擊只能獲得 100 分,但連續踩踏多個敵人而不著地可以獲得額外積分。鏈條中的第一個敵人價值 100 分,接下來的敵人分別價值 200、400、800、1000、2000、4000 和 8000 分。繼續踩踏超過 8000 分的敵人,每消滅一個敵人就會獲得一條額外生命。特定敵人可能會提供不同的分數。
子彈比爾
導彈比爾
File:SMB3 enemy Bullet Bill.png 子彈比爾 是比爾發射器發射的黑色大子彈。比爾發射器被戰略性地放置在許多關卡中。它們甚至可以在地面上找到,即使是小馬里奧也無法躲避飛向他的子彈。盡力避開它們,或者把它們踩踏出路。
File:SMB3 enemy Missile Bill.png 導彈比爾 類似於一個閃爍紅色的子彈比爾。導彈比爾會鎖定一個目標(比如馬里奧),如果它錯過了,它會轉過身來。但是,一旦它轉過身,它會一直沿著直線飛行,直到飛出螢幕或被消滅。
憤怒的太陽
刺
File:SMB3 enemy Angry Sun.png 憤怒的太陽 是一個相當小的太陽,長著一張憤怒的臉。它們是遊戲中第二不常見的敵人,只出現了兩次;一次是在世界 2-流沙,另一次是在世界 8-2。為了攻擊馬里奧,憤怒的太陽會俯衝下來,試圖擊中這位水管工,然後再回到天空。它們可以用庫巴殼、錘子馬里奧的錘子,或者撞擊無敵的馬里奧來殺死。
File:SMB3 enemy Spike.png 刺 是小型綠色的烏龜狀敵人,有著不同尋常的攻擊方式:它們從嘴裡拔出帶刺的球,然後朝馬里奧扔去。就像拉基圖斯一樣,它們擁有無限量的彈藥。帶刺的球會筆直地飛過,甚至可以穿過方塊和地形。刺容易受到所有型別的攻擊。
炸彈兵
鏈子犬
File:SMB3 enemy Bob-omb.png 炸彈兵 是一個活的炸彈。它們通常由大炮發射,但偶爾也會在地面上行走。如果馬里奧踩到一個炸彈兵,它會變成靜止的,可以被拿起並用作武器。然而,它會在幾秒鐘後爆炸,即使馬里奧仍在拿著它。在後面的鮑澤坦克關卡中,炸彈兵在出現後幾秒鐘就會自行爆炸。它們無法被火球摧毀,但可以被其他炸彈兵的爆炸消滅。
File:SMB3 enemy Chain Chomp.png 鏈子犬 類似於一個球和一條鏈子,並且有著非常像狗的行為,包括吠叫。它們被綁在一個方塊上,但如果過了 160 秒,它們就會被釋放。有四種方法可以消滅鏈子犬:使用星星、用錘子馬里奧向它扔庫巴殼或錘子,以及用狸貓馬里奧的石像狀態踩踏它。
火蛇
火焰犬
火蛇 是火焰,後面跟著四個火球。火蛇追逐馬里奧,試圖把它點燃。它們會從一個地方跳到另一個地方,無論馬里奧在哪個方向。它們只能透過用殼或錘子擊打它、使用無敵之星、用浣熊尾巴擊打它,或者用石像馬里奧踩踏它來消滅。
火焰犬 是鏈子犬的表親,但它是用四個火球而不是鏈子連線在一起的。它們能夠飛行,它們會向馬里奧吐火球。當它們的火球用完時,它們會追趕馬里奧,然後爆炸。它們可以用踩踏、錘子、星星和尾巴攻擊消滅。