三維電子顯微鏡/什麼是 3DEM？
冷凍電子顯微鏡，通常簡稱為“冷凍電鏡”，已發展成為涵蓋各種實驗方法。冷凍電鏡正日益成為一種主流技術，用於在分子解析度下研究細胞、病毒和蛋白質結構[1]。影像使用電子顯微鏡生成，該顯微鏡使用電子作為輻射，由放置在高真空下的源發射，然後在 80-300 kV 的加速電壓下沿顯微鏡柱向下推動[1]。與光學顯微鏡相比，電子顯微鏡的一個很大區別是兩種方法的解析度，電子顯微鏡具有更高的解析度。顯微鏡的解析度與用於形成影像的照射波長直接相關。使用的電子照射會導致生物樣品受到嚴重損傷。減少電子誘導樣品損傷的一種方法是在低溫下進行該技術。在低溫下（例如，用液氮冷卻的液態乙烷）冷凍水溶液是用於製備冷凍電鏡應用樣品的一種常用方法[1]。這種方法已被證明可以很大程度地減少輻射損傷的影響，這反過來又允許研究人員使用更高劑量的電子來提高信噪比，因為輻射損傷減少了。冷凍電鏡的常用變體是單粒子分析。使用這種技術，從大量 2D 投影影像（例如不同方向上相同蛋白質複合物的副本）中獲得的資料被組合起來，以生成結構的 3D 重建[1]。
粒子挑選試圖正確地確定粒子的位置，並在影像中區分粒子與任何汙染物[2]。可以手動或透過使用自動演算法選擇粒子。自動演算法力求將“正類”粒子與“負類”汙染物或噪聲區分開來[3]。自動演算法可能會出現 1 類錯誤或 2 類錯誤，它們會錯誤地識別出正樣本或負樣本。
對比度傳遞函式 (CTF) 是由於透射電子顯微鏡中光學性質缺陷導致的影像資料的失真[4]。CTF 有兩個原因，它們都與電子顯微鏡中的透鏡系統有關。第一個原因是球面像差，它會導致多個焦點，從而使影像變得模糊。CTF 的第二個原因是電子顯微鏡中使用的欠焦。為了獲得高解析度的 3D 影像，必須校正 CTF。
堆疊是相同結構的類似影像的集合。可以透過刪除不必要的資訊來獲得單個影像，以提高處理速度[5]。粒子框選會裁剪出影像中粒子畫素尺寸 150% 的部分。粒子對比度區分了負染和玻璃化冰上的粒子，當粒子是黑色背景上的黑色時，會反轉。CTF 校正將粒子在資料及其反轉之間交替，以校正粒子。
在粒子對齊中，粒子的影像在許多不同的方向上移動和旋轉，以嘗試對齊粒子。必須將它們移動和旋轉以對齊在一起以獲得平均影像。平均時的目標是最大化影像的互相關[6]。粒子對齊可以分類為基於參考或無參考。根據分類，可以使用不同型別的自動包進行對齊，例如 Xmipp 最大似然對齊、Spider 參考似然對齊和 EMAN Refine 2D 無參考對齊[7]。
需要多個 2D 影像才能獲得 3D 影像的結構。粒子根據結構特徵（包括公共線、形狀和傾斜）進行選擇和組織[8]。這些粒子與其他結構相似的粒子聚集在一起，然後平均在一起[2]。3D 模型的重建依賴於粒子的方向，如中心投影定理所述[1]。
使用多種方法（例如隨機圓錐傾斜或角度重構）獲得初始 3D 結構後，獲得的圖譜被用作 3D 參考來細化單粒子方向引數（兩個用於位置，三個用於方向）。然後可以透過迭代改進結構，交替進行位置和方向確定以及 3D 重建。FSC 傅立葉殼相關）和其他解析度標準可用於跟蹤結構細化的進展情況，當沒有進一步改進時，細化將終止。IMAGIC、SPIDER、FREALIGN 等不同的程式可用於此目的[9]。
- ↑ a b c d e Milne, Jacqueline L, Mario J Borgnia 和 Alberto Bartesaghi。“冷凍電鏡——非顯微鏡學家的入門。”Febs Journal.280 (2012): n. page. Print. 無效的
<ref>標記；名稱“electron”在不同的內容中被多次定義。 - ↑ a b Voss, Neil。“粒子挑選。”羅斯福大學，沙堡。2013年9月13日。講座。
- ↑ Langlois, Robert 和 Joachim Frank。“關於冷凍電鏡中半自動粒子選擇演算法比較中所用術語的澄清。”結構生物學雜誌175.3 (2011): 348-52. Science Direct. 霍華德休斯醫學研究所。網路。2013年12月3日。
- ↑ Voss, Neil。“對比度傳遞函式。”羅斯福大學，沙堡。2013年9月27日。講座。
- ↑ Voss, Neil。“粒子框定。”羅斯福大學，沙堡。2013年9月27日。講座。
- ↑ Sigworth, F.J。“單粒子影像精修的極大似然法。”結構生物學雜誌。122 (1998): n. page. Print.
- ↑ Voss, Neil。“粒子對齊。”羅斯福大學，沙堡。2013年10月4日。講座。
- ↑ Voss, Neil。“初始模型問題。”羅斯福大學，沙堡。2013年11月8日。講座。
- ↑ Voss, Neil。“3D重建。”羅斯福大學，沙堡。2013年10月25日。講座。