蛋白質組學/蛋白質鑑定 - 質譜
介紹
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介紹
- 質譜概述
質譜是一種技術，其中氣相分子被電離，並且透過觀察離子在施加電場時的加速差異來測量它們的質荷比。較輕的離子將更快地加速並首先被檢測到。如果質量測量得足夠精確，那麼就可以確定分子的組成。在蛋白質的情況下，可以確定序列。大多數提交質譜分析的樣品都是化合物的混合物。獲得光譜以給出樣品中所有化合物的質荷比。質譜法也被稱為“質譜”或簡稱為 MS。質譜法闡明瞭細胞系統內的分子機制。它用於識別蛋白質、功能相互作用，並且它進一步允許確定亞基。細胞中的其他分子，如脂質成分，也可以被定義。
質譜儀由幾個不同的部分組成：一個電離樣品的源，一個根據質荷比分離離子的分析器，一個“看到”離子的檢測器，以及一個處理和分析結果的資料系統。您還可以使用質譜法測量離子的相對丰度。不同的化合物具有不同的電離能力，因此您的離子的強度與濃度沒有直接關係。
質譜法可能是一種高通量分析方法，因為與凝膠方法相比，質譜法能夠快速測量質譜，並且樣品處理量最少。
它是一種分析方法，具有蛋白質組學以外的多種用途，例如同位素和測年、微量氣體分析、原子定位對映、汙染物檢測和太空探索。
- 質譜法歷史
這項技術的起源可以追溯到 100 多年前對帶電環境中氣體激發的首次研究。這項開創性的工作透過J.J 湯姆森在 1913 年透過質荷比區分來識別氖的兩種同位素（氖-20 和氖-22）。在接下來的五十年中，該技術的根本基礎得到了進一步發展。在 1959 年道化學公司研究人員將氣相色譜與質譜聯用後，人們認識到該技術作為一種高度準確的定量方法來探索化合物的全部潛力，從而引發了一波發展浪潮，一直持續到今天。質譜法的精確性導致了同位素的發現。
- 質譜法對蛋白質組學應用的影響
質譜法技術是蛋白質組學領域中一項寶貴的工具。它可用於透過質譜法技術的變體來識別蛋白質。蛋白質組學最常見的首要方法是自下而上的方法，其中蛋白質被蛋白酶（如胰蛋白酶）消化，然後透過肽質量指紋圖譜、碰撞誘導解離、串聯質譜法和電子捕獲解離分析肽。一旦確定了肽的質量，就可以將質量列表傳送到資料庫（例如 MASCOT），在該資料庫中，該列表與所有已知肽的質量進行比較。如果足夠多的肽與已知蛋白質匹配，則可以識別您的蛋白質。如果您的肽的質量與已知蛋白質不匹配，則可以使用 MS/MS 方法對您的肽進行從頭測序；您隔離您的肽並在肽鍵骨架上將其斷裂，形成 y 和 b 離子，您可以從中確定序列。自下而上方法的優點是，與整個蛋白質離子相比，胰蛋白酶肽離子的尺寸小，易於生化處理，因為它們的質量相對較小，更容易確定。除了自下而上的方法外，還有另一種方法是自上而下的方法。在自上而下的方法中，使用質譜儀直接分析完整的蛋白質，而無需像自下而上的方法那樣進行溶液消化。自上而下方法的優點是它有時可以提供蛋白質的完整覆蓋率。但是，由於與小的肽片段相比，完整的蛋白質在生化處理方面難以處理，因此自上而下的方法難以分析。
質譜法在蛋白質組學中的另一個用途是蛋白質定量。透過用穩定的較重同位素標記蛋白質，您可以反過來確定蛋白質的相對丰度。現在，公司（如 iTRAQ (應用生物系統)）生產了套件，以便在高通量水平上執行此操作。
識別生物分子的最有效方法之一是確定其分子質量及其碎片後組成分子的質量。有兩種主要的執行此操作的方法。第一個是電噴霧電離 (ESI)，其中感興趣的離子透過施加高電場從溶液中形成。這是透過對毛細管的尖端施加高電場來實現的，溶液將透過該毛細管。樣品將與氮氣流一起噴入電場，以促進脫溶。液滴會形成並在真空區域蒸發。這會導致液滴上的電荷增加，現在據說離子是多電荷的。這些多電荷離子現在可以進入分析器。ESI 是一種選擇方法，因為它具有以下特性：（1）相轉換過程的“柔和性”允許非常脆弱的分子保持完整地電離，甚至在某些非共價相互作用中得以保留，以進行 MS 分析。（2）透過液相色譜洗脫的餾分可以噴入質譜儀，從而允許進一步分析混合物。（3）多電荷離子的產生允許測量高分子量生物聚合物。與單電荷分子相比，分子上的多個電荷會降低其質荷比。分子上的多個電荷也允許改進的碎片，這反過來又允許更好地確定結構。第二個是基質輔助雷射解吸/電離 (MALDI)，其中感興趣的分子離子透過雷射脈衝照射孤立在過量基質分子中的樣品而形成。這使得能夠確定大於 200,000 道爾頓的大型生物分子和合成聚合物的質量，而不會降解感興趣的分子。MALDI 的優點是其穩健性、高速以及對汙染物和生化緩衝液的相對免疫。
一種通常與 MALD 一起使用的質譜儀是 TOF 或飛行時間質譜儀。這使得能夠快速準確地確定摩爾質量，以及測序重複單元並識別聚合物新增劑和雜質。這項技術基於紫外線吸收基質，其中基質和聚合物與過量的基質和溶劑混合在一起，以防止聚合物聚集。然後將該混合物置於探針的尖端；然後在真空條件下除去溶劑。這會產生共結晶的聚合物分子，這些分子均勻地分散在基質中。將脈衝雷射束設定為適當的頻率，並將能量射向基質，基質會部分汽化。反過來，基質中均勻分散的聚合物被帶入氣相併帶電。為了獲得極好的信噪比，執行多個雷射脈衝。峰的形狀得到改善，確定的摩爾質量更加準確。最後，在 TOF 分析儀中，樣品中的分子由於電勢能差而獲得相同的平移動能。這些離子分子在沒有電場的真空中沿相同的距離向下移動。最小的離子首先到達檢測器，檢測器會為每個離子產生訊號。來自多個雷射脈衝的累積資料會產生 TOF 質譜，該質譜將檢測器訊號轉換為時間的函式，這反過來可以用來計算離子的質量。
除了這些電離技術外，還開發了功能強大的質譜分析儀。這些分析儀以高精度和高速測量完整電離的生物分子的質荷比及其碎片光譜。碎片光譜的測量稱為串聯質譜法或 MS/MS。與單級 MS（使用完整的母離子）結合，串聯質譜法可用於幫助闡明蛋白質，因為闡明問題將簡化為組裝碎片蛋白質的拼圖碎片。
參考文獻
- 美國質譜學會 - 什麼是 MS？，http://www.asms.org/whatisms/p4.html
- 後基因組時代質譜法
- 生物化學年度評論 第 80 卷：239-246（卷出版日期 2011 年 7 月）DOI：10.1146/annurev-biochem-110810-095744 https://ted.ucsd.edu/webapps/portal/frameset.jsp?tab_tab_group_id=_2_1&url=%2Fwebapps%2Fblackboard%2Fexecute%2Flauncher%3Ftype%3DCourse%26id%3D_767_1%26url%3D
- 伊利諾伊大學厄巴納-香檳分校化學科學學院 http://scs.illinois.edu/massSpec/ion/esi.php
- 南密西西比大學聚合物與高效能材料學院 http://www.psrc.usm.edu/mauritz/maldi.html