蛋白質組學/蛋白質鑑定 - 質譜
簡報
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介紹
- 質譜概述
質譜是一種技術，其中氣相分子被電離，並且透過觀察離子在施加電場時加速的差異來測量它們的質荷比。較輕的離子將更快地加速並首先被檢測到。如果質量測量得足夠精確，那麼可以識別分子的組成。在蛋白質的情況下，可以識別序列。提交到質譜的大多數樣品都是化合物的混合物。獲取光譜以給出樣品中所有化合物的質荷比。質譜法也稱為“質譜”或簡稱MS。質譜法揭示了細胞系統內的分子機制。它用於識別蛋白質、功能相互作用，並且進一步允許確定亞基。還可以定義細胞中的其他分子，例如脂質成分。
質譜儀由幾個不同的部分組成：一個電離樣品的源，一個根據質荷比分離離子的分析儀，一個“看到”離子的檢測器，以及一個處理和分析結果的資料系統。您還可以使用質譜法測量離子的相對丰度。不同的化合物具有不同的電離能力，因此您的離子的強度與濃度沒有直接關係。
由於能夠快速測量質譜並且與凝膠方法相比，樣品處理量最小，因此質譜法可以成為一種高通量分析方法。
它是一種分析方法，在蛋白質組學之外具有各種用途，例如同位素和年代測定、痕量氣體分析、原子位置對映、汙染物檢測和太空探索。
- 質譜的歷史
這項技術的歷史可以追溯到 100 多年前在帶電環境中首次對氣體激發的研究。這項開創性的工作透過J.J Thomson 在 1913 年透過質荷比區分來識別氖的兩種同位素（氖-20 和氖-22）。在接下來的 50 年中，該技術的根本基礎得到了進一步發展。在 1959 年將氣相色譜與質譜聯用後，Dow Chemical 的研究人員認識到該技術作為一種高度準確的定量方法來探索化合物的全部潛力，從而引發了一波發展浪潮，這些浪潮一直持續到今天。質譜的精確性導致了同位素的發現。
- 質譜對蛋白質組學應用的影響
質譜技術是蛋白質組學領域中的一項寶貴工具。它可以透過質譜技術的各種變化來識別蛋白質。蛋白質組學最常見的第一種方法是自下而上的方法，其中蛋白質被蛋白酶（如胰蛋白酶）消化，然後透過肽質量指紋圖譜、碰撞誘導解離、串聯質譜和電子俘獲解離來分析肽。確定肽質量後，可以將質量列表傳送到資料庫（例如 MASCOT），在該資料庫中，將該列表與所有已知肽的質量進行比較。如果足夠多的肽與已知蛋白質的肽匹配，則可以識別您的蛋白質。如果您的肽的質量不匹配已知蛋白質，則可以使用 MS/MS 方法透過從頭測序對您的肽進行測序；您隔離您的肽並沿肽鍵骨架斷裂，形成 y 和 b 離子，您可以從中確定序列。自下而上方法的優點是，與整個蛋白質離子相比，胰蛋白酶肽離子的尺寸小，易於生物化學處理，因為它們相對較小的質量更容易確定。除了自下而上的方法外，另一種方法是自上而下的方法。在自上而下的方法中，完整的蛋白質透過質譜儀直接分析，無需像自下而上的方法那樣進行溶液消化。自上而下方法的優點是可以有時提供蛋白質的完整覆蓋範圍。但是，由於與小的肽片段相比，整個蛋白質難以生物化學處理，因此自上而下的方法難以分析。
質譜在蛋白質組學中的另一個用途是蛋白質定量。透過用穩定的較重同位素標記蛋白質，反過來可以確定蛋白質的相對丰度。現在，公司生產了各種試劑盒，例如 iTRAQ (應用生物系統)，以便在高通量水平上執行此操作。
確定生物分子的分子量及其在斷裂後的組成分子的質量，是識別生物分子最有效的方法之一。執行此操作的兩種主要方法。第一個是電噴霧電離 (ESI)，其中感興趣的離子透過施加高電場從溶液中形成。這是透過將高電場施加到毛細管的尖端來實現的，溶液將從該尖端穿過。樣品將與氮氣流一起噴射到電場中，以促進去溶劑化。液滴將形成並在真空區域蒸發。這會導致液滴上的電荷增加，並且現在據說離子是多電荷的。這些多電荷離子現在可以進入分析儀。由於以下特性，ESI 是首選方法：(1) 相變過程的“柔和性”允許非常脆弱的分子保持完整地電離，甚至在某些非共價相互作用中保持完整，以便進行 MS 分析。(2) 透過液相色譜的洗脫餾分然後可以噴射到質譜儀中，允許對混合物進行進一步分析。(3) 多電荷離子的產生允許測量高分子量生物聚合物。與單電荷分子相比，分子上的多個電荷將降低其質荷比。分子上的多個電荷也有助於改善碎裂，從而更好地確定結構。第二個是基質輔助雷射解吸/電離 (MALDI)，其中感興趣的分子離子透過雷射脈衝撞擊在樣品上形成，樣品被隔離在過量基質分子中。這使得能夠確定大於 200,000 道爾頓的大型生物分子和合成聚合物的質量，而不會降解感興趣的分子。MALDI 的優點是其穩健性、高速以及對汙染物和生化緩衝液的相對免疫力。
一種經常與 MALD 結合使用的質譜儀是 TOF 或飛行時間質譜法。這使得能夠快速準確地確定摩爾質量，以及對重複單元進行測序並識別聚合物新增劑和雜質。該技術基於紫外線吸收基質，其中基質和聚合物與過量的基質和溶劑混合在一起，以防止聚合物聚集。然後將這種混合物放在探針的尖端；然後在真空條件下除去溶劑。這會產生共結晶的聚合物分子，這些分子均勻地分散在基質中。脈衝雷射束設定為適當的頻率，併發射能量到基質中，基質部分汽化。反過來，基質中均勻分散的聚合物被帶入氣相併帶電。為了獲得出色的信噪比，執行多次雷射射擊。峰的形狀得到改善，測定的摩爾質量更加準確。最後，在 TOF 分析儀中，樣品中的分子由於電勢能差而獲得了相同的平移動能。這些離子分子沿沒有電場且距離相同的真空管向下運動。最小的離子最先到達檢測器，檢測器會為每個離子產生訊號。來自多次雷射射擊的累積資料會產生一個 TOF 質譜，它將檢測器訊號轉換為時間的函式，反過來可以用來計算離子的質量。
除了這些電離技術外，還開發了功能強大的質譜儀。這些分析儀測量完整電離生物分子的質荷比及其碎裂光譜，具有很高的準確性和速度。碎裂光譜的測量稱為串聯質譜或 MS/MS。與單級 MS（具有完整的母離子）結合使用，串聯質譜可以用來幫助闡明蛋白質，因為闡明問題將簡化為組裝碎裂蛋白質的拼圖碎片。
參考資料
- 美國質譜學會 - 什麼是 MS？，http://www.asms.org/whatisms/p4.html
- 後基因組時代中的質譜法
- 生物化學年度評論第 80 卷：239-246（卷出版日期 2011 年 7 月）DOI：10.1146/annurev-biochem-110810-095744 https://ted.ucsd.edu/webapps/portal/frameset.jsp?tab_tab_group_id=_2_1&url=%2Fwebapps%2Fblackboard%2Fexecute%2Flauncher%3Ftype%3DCourse%26id%3D_767_1%26url%3D
- 伊利諾伊大學厄巴納-香檳分校化學科學學院 http://scs.illinois.edu/massSpec/ion/esi.php
- 南密西西比大學聚合物和高效能材料學院 http://www.psrc.usm.edu/mauritz/maldi.html