蛋白質組學/蛋白質鑑定 - 質譜/儀器

本節

質譜儀是如何工作的？

質譜儀由三個部分組成：離子源、質量分析器和檢測器。未知樣品，可能是固體、液體、溶液或蒸汽，被送入電離源。電離樣品後，樣品的離子被送入質量分析器區域，在那裡根據質荷比進行分離。一旦被分析器分離，離子就進入質譜儀的檢測器部分。在這一點上，機器計算每個不同離子的質荷比和相對丰度。根據這些資訊，可以建立像右邊這樣的光譜圖。

大多數質譜儀都保持在真空狀態，以提高離子從電離源到檢測器移動過程中不受空氣分子碰撞干擾的機率。

離子源

離子源是質譜儀中將樣品電離的部件。電離主要用於將樣品以蒸汽離子的形式呈現，以便質量分析器對其進行作用，並由離子檢測器測量。有許多不同的方法可以電離樣品，例如正離子或負離子模式。選擇的電離方法應取決於樣品的型別和質譜儀的型別。

電離方法

File:ES-MassSpec.jpeg

電噴霧電離

基質輔助雷射解吸電離

有三種類型的電離方法，電子電離、化學電離和光誘導電離。電子電離涉及對樣品施加電流以誘導電離。化學電離涉及樣品與試劑分子相互作用以誘導電離。產生的離子通常用符號表示，這些符號表明電離的性質，例如 [M+H]+ 用於表示被質子化的分子。

• 電子電離
  
  • 電噴霧電離
    
  • 場解吸/場電離
    
• 化學電離
  
  • 基質輔助雷射解吸電離
    
  • 快原子轟擊
    
  • 熱電離
    

蛋白質組學中常用的方法是“基質輔助雷射解吸電離”或 MALDI 和“電噴霧電離”，也稱為 ESI。大氣壓化學電離和大氣壓光電離也是兩種形式。

MALDI 使用固體支撐靶板，其中在板上點塗 UV 活性基質（固體或液體），然後在基質上點塗樣品。雷射照射到結晶基質上的點，並將能量從基質分子轉移到樣品。這種能量轉移使樣品汽化，並將一束離子送入 MALDI 源。然後收集這束離子並保持在源中，直到脈衝將它們同時傳送出去。如果 MALDI 連線到飛行時間 (TOF) 質量分析器，這些離子就會被送到 TOF 管（通常約 2 米）中，並根據它們的速率（輕離子先到達）進行分離。MALDI 是蛋白質組學的首選儀器，因為它易於讀取光譜；大多數離子都在 +1 電荷狀態 [M+H] 中被發現。

另一方面，電噴霧是透過將溶解在弱酸性溶液中的樣品注射到帶有約 10 伏電壓的加熱毛細管中來完成的。這使得在毛細管尖端形成高電荷粒子。當粒子蒸發時，它們的電荷/體積增加到電荷排斥力接管的程度，粒子會爆炸。會形成一個小液滴，繼續這個過程，直到單個分子處於氣相併帶電。然後，這些離子將進入分析器（通常是四極杆），逐個質量進行掃描。電噴霧中的分子往往是多電荷的，即使四極杆的上限質量為 2000 m/z，多電荷也允許識別高質量離子或蛋白質。蛋白質將具有一個電荷包絡，其中每個峰具有不同的電荷量。需要專門的軟體來將多電荷物種峰解捲成單個質量峰，例如 Waters 的 MassLynx。這種電離形式適用於大多數化合物，但對於中性或低極性分子來說並不是最佳選擇。

大氣壓化學電離涉及樣品與試劑分子相互作用以誘導電離。與電噴霧電離一樣，液體透過毛細管泵送。在尖端，它被霧化，併發生電暈放電，使分子電離。這些分子與分析物相互作用並轉移它們的電荷。這種電離形式適用於小的熱穩定分子。

大氣壓光電離在分子被霧化後使用光子激發和電離分子。這種電離形式適用於中性化合物。

質量分析器

質量分析器是根據它們的質荷比分離離子源產生的離子的部件。質量分析器基於帶電粒子在電場或磁場中的原理。利用洛倫茲力定律和牛頓第二運動定律，可以生成以下方程

    $({\frac {m}{q}})\mathbf {a} =\mathbf {E} +\mathbf {v} \times \mathbf {B}$

其中 m 是質量，離子電荷是 q，a 是加速度，E 是電場，離子速度和磁場的向量叉積是 v x B。該方程表明，兩個具有相同質荷比 (m/q) 的粒子將表現出完全相同的行為。

所以這個方程實際上是在說，質荷比充當離子加速度的決定因素，這也可能表示為電場加上離子速度和磁場的叉積之和。

掃描質量分析器

掃描質量分析器需要根據離子的相對丰度和質荷比進行分離。電磁場用於根據離子的質荷比分離離子，透過使用狹縫，它們能夠調節哪些質荷比離子到達檢測器。一旦選擇了一個特定的質荷比，離子電流就會被記錄為時間的函式，這類似於質量。

扇形質譜儀

使用質量分析器（在其內部使用磁性、電氣或靜態扇形）的質譜儀稱為扇形儀器。這也與扇形組合使用，例如 BEB，磁性-電氣-磁性。在當今，這些扇形儀器大多是雙聚焦的，即離子束在方向和速度方面都被聚焦。下面介紹磁性扇形質譜儀的工作原理，想象一個位於兩個電磁體之間的管狀物。當電子從一端透過管子到另一端時，磁場透過對其施加轉動力來彎曲電子流。然後確定 m/z 比例。

Orbitrap 質譜儀

Orbitrap 質譜儀是將離子置於切向產生的電場中的質譜儀。這些離子也捕獲在外部電極之間，而離子被靜電吸引到內部電極，這種吸引力被離心力平衡。因此，這些離子以圓周方式圍繞內部電極運動，並且以特定 m/z 比例來回運動。透過使用這種基於 m/z 比例的離子振盪，捕獲器可以充當質量分析儀。

四極杆質譜儀

您可以將此方法視為一個過濾器或漏斗，它只允許某些離子質量透過。這個“漏斗”實際上是正負帶電金屬桿的組合，它們一起形成了一個通道，離子透過該通道。理論上，只有選定的質量才能透過通道，因為所有其他離子將無法穩定地穿過通道，而是會撞擊四極杆，阻止離子到達檢測器。

離子阱四極杆質譜儀

四極杆離子阱質譜儀由一個環和兩個端蓋的雙曲線電極組成，這是該儀器的核心。在這種方法中，離子被捕獲，然後從離子阱中依次彈出到傳統的電子倍增檢測器中。這樣，所有離子都可以在質量分析過程中被儲存。最近的研究表明，在捕獲體積中使用 1 mtorr 的氦氣可以顯著提高儀器的解析度，離子的動能降低，離子軌跡收縮到捕獲器的中心。可以用給定 m/z 的離子形成一個數據包。由於解析度高且成本低廉，這種質譜儀在商業用途上被廣泛使用。

線性四極杆質譜儀

線上性離子阱質譜儀中，離子被捕獲在一組四極杆棒內，以徑向保持離子，並用端部電極以靜態電勢保持離子軸向。簡單地說，與使用三維場的四極杆離子阱不同，線性四極杆離子阱使用二維場。它具有選擇性質量過濾器，用於檢測特定 m/z 比例的離子。這種方法具有更高的離子儲存容量和更快的掃描技術的優勢。

飛行時間質量分析儀

TOF（飛行時間）是一種質量分析儀，它允許離子流過無場區域；這使得速度更快的離子（即質量更輕的離子）首先到達檢測器。這與 MALDI 尤其相容，因為 TOF 需要脈衝式儀器作為其源。這樣，離子在 MALDI 源中產生並保持在那裡一段時間，所有離子在完全相同的時間脈衝進入 TOF。這樣，如果所有離子具有相同的動能，則質量較低的離子將具有更高的速度，並首先到達檢測器；而質量較高的離子將具有較低的速度，最後到達檢測器。

離開源的離子的動能由下式給出

    $T=eV={\frac {mv^{2}}{2}}$

其中速度 v 由路徑長度 L 除以時間 t 定義。

    $v={\frac {L}{t}}$

將此方程代入第一個方程並求解時間，得到

    $t=L*{\sqrt {({\frac {m}{e}})*({\frac {1}{2V}})}}$

從這個方程中，您可以很容易地看到質量如何直接影響飛行時間。質量與時間成正比。使用方程的 m/e 部分，您可以清楚地看到較大的質量意味著更長的時間，反之亦然，較低的質量意味著較小的 m/e，因此飛行時間更短。

離子迴旋共振質譜儀

ICR 是一種捕獲離子質量分析儀，專門定義為靜態捕獲器。它基本上是一個盒子，有三個平行的金屬側面。捕獲離子分析儀透過將離子保持在捕獲器中，並使用正負帶電電場以一系列精心安排的時間事件來控制離子，從而工作。

ICR 的工作原理是，在磁場中，離子以圓周路徑運動，其頻率與質量有關。因此，使用迴旋頻率，您可以推測出質量。將磁場中的洛倫茲力與向心力的方程等價，得到

    $evB={\frac {mv^{2}}{r}}$

然後，您可以輕鬆地求解上述方程以得到頻率 F，即

    $F={\frac {v}{r}}$

具有相同質荷比的離子組將具有相同的迴旋頻率，但可能不同步運動，這就是為什麼需要激發脈衝將共振離子與激發脈衝同步的原因。接下來，經過 ICR 單元接收板附近的離子會產生“映象電流”，這些電流可以被收集、放大和分析。在接收板中記錄的訊號取決於離子數量及其到接收板的距離。

傅立葉變換

這種質譜儀包含一個質量分析儀，該分析儀使用離子的迴旋頻率來確定它們的 m/z 比例。這裡使用一個磁場，其中具有電捕獲板（稱為彭寧阱）用於保持離子。一個與磁場成直角的振盪電場用於將捕獲的離子激發到更大的迴旋半徑。這會導致振盪離子資料包。捕獲板檢測訊號作為映象電流，併產生一個包含正弦波的干涉圖，稱為自由感應衰減 (FID)。透過對該資料執行傅立葉變換，可以生成具有有用訊號的質譜圖。

檢測器

透過分析儀的離子現在透過所需的方法被分離。這種質譜儀元件記錄了離子經過表面時產生的電荷，或者離子撞擊表面時產生的電流。根據這些電荷或電流，可以生成質譜圖，以及測量每個 m/z 處存在的離子總數。由於進入檢測器的離子數量在任何給定時刻都非常少，因此通常需要訊號放大。

下一節： 質譜型別

參考文獻

• 實驗技術：MALDI TOF，http://www.microbiology.science.ru.nl/tech/malditof/
  
• 質譜入門，http://www.astbury.leeds.ac.uk/facil/MStut/mstutorial.htm
  
• 電子電離源：基礎知識，http://www.spectroscopymag.com/spectroscopy/article/articleDetail.jsp?id=358670
  
• 其他產生離子的技術有哪些？，http://www.asms.org/whatisms/p11.html
  
• 磁扇區質譜，http://www.wooster.edu/Chemistry/analytical/ms/default.html
• http://en.wikipedia.org/wiki/Orbitrap
• 四極杆離子阱質譜的來龍去脈，http://www.abrf.org/ABRFNews/1996/September1996/sep96iontrap.html
• http://en.wikipedia.org/wiki/Quadrupole_ion_trap
• 傅立葉變換離子迴旋共振理論：簡要回顧，http://www.emsl.pnl.gov/docs/msd/mass_spec/home/fticrtut.html
• 傅立葉變換質譜，http://www.bumc.bu.edu/Dept/Content.aspx?DepartmentID=385&PageID=7205

文章摘要

液相色譜-質譜聯用技術在臨床生化中的原理及應用

Pitt JJ. 臨床生化學評論 卷：3019-34 (2009)

主要關注點

液相色譜 - 質譜聯用技術的一個優勢是，它有多種配置，可以根據實驗需要獲得更有針對性的結果。

摘要

LC-MS 系統的方框圖

由於技術的效率低下，LC-MS 技術起步緩慢。然而，在 1990 年代中期，隨著新技術的開發，它變得越來越流行。這部分是由於其高度特異性，以及能夠處理比當時其他可用方法（如 GC-MS）更復雜的混合物的能力。質譜法首先將樣品電離，生成帶電的分子碎片，然後分析它們的質荷比。LC-MS 中的質譜部分使用不同的技術來獲得不同的結果，其中一些技術比其他技術更通用，例如改變離子源、改變質量分析器、改變離子抑制以及改變直接進樣方法。

可以在臨床上使用的不同離子源包括電噴霧電離源、大氣壓化學電離源或大氣壓光電離源。電噴霧電離，也稱為 ESI，適用於極性分子；代謝物、異源生物和肽就是一些例子。大氣壓化學電離源，也稱為 APCI，是分析小分子熱穩定分子和中性非極性分子（如遊離類固醇）的理想分析儀。大氣壓光電離，也稱為 APPI，適用於中性化合物，如類固醇。

有四種不同的質量分析器可供使用；它們是四極杆分析器、飛行時間分析器、離子阱分析器和混合分析器。四極杆分析器使用廣泛，因為它們易於掃描且能夠提供高質量的定量資料。飛行時間分析器由於其高靈敏度，適用於分析小分子。離子阱分析器能夠多次對離子進行碎片化，從而提供所謂的 MSⁿ 功能。混合分析器可以在離子阱模式和傳統的四極杆模式之間切換。

在 LC-MS 的液相色譜部分，也可以改變不同的步驟，使該程式更加通用，例如改變流速、流動相、分離度和通量以及定量（校準）。LC-MS 中涉及的引數和條件可以改變以最佳化分析。但是，這些條件特定於特定的分析物和 LC 分離。因此，不存在通用條件。這些條件中的一些包括使用分析物的稀溶液以及使用單級質譜或串聯質譜。重要的是確保 LC-MS 系統執行正常，並採用協議來檢測與正常效能的偏差。LC-MS 用於生化篩查遺傳性疾病以及治療藥物監測和類固醇激素。

新術語

GC-MS

氣相色譜-質譜聯用 (GC-MS) 是一種將氣相色譜和質譜的特點結合起來的方法，用於識別測試樣品中的不同物質。 (http://en.wikipedia.org/wiki/GC-MS)

離子源

產生氣體離子、聚焦、加速並以窄束髮射的裝置。也稱為離子槍；電離源。 (http://www.answers.com/topic/ion-source )

校準

一組刻度，用於指示值或位置——通常用複數形式。 (http://www.merriam-webster.com/dictionary/calibration )

偏差

與公認的行為規範明顯或顯著偏離。 (http://www.merriam-webster.com/dictionary/deviation )

異源生物

一種對活體生物體而言是外來的化合物（如藥物、農藥或致癌物質）。 (http://www.merriam-webster.com/dictionary/xenobiotics )

課程相關性

這如何與蛋白質組學課程相關？

能夠分析蛋白質的組成非常重要，以便我們能夠了解該蛋白質對生物體的影響。能夠看到給定蛋白質與其正常對應物之間的差異可能有助於理解遺傳疾病。LC-MS 使科學家能夠進行蛋白質分離。

網站總結

什麼是質譜法？

Chiu CM, Muddiman DC. http://www.asms.org/whatisms/index.html (3/28/09)

主要關注點

本網站討論了什麼是質譜法，它的歷史以及它的工作原理。

摘要

質譜法是一種強大的分析技術，用於識別未知化合物、定量已知化合物以及闡明分子的結構和化學性質。可以識別出濃度非常低的化合物。質譜法被各種專業人士使用，例如醫生、天文學家和生物學家。例如，它可以監測麻醉師在手術過程中患者的呼吸，並確定太空中發現的分子物質的成分。它可以用來識別生物分子的結構以及對它們進行測序。它還用於識別和定量複雜有機混合物的化合物。質譜法是由 J.J. 湯姆遜在真空管中發明的。他的發明被用於發現許多同位素，確定同位素的相對丰度，並測量它們的“精確質量”，這對從地質年代學到生化研究等不同領域的後續發展奠定了基礎。

質譜儀是一種測量單個分子的質量的儀器，這些分子透過帶電而被轉化為離子。質譜儀實際上並沒有直接測量分子質量，而是測量從分子形成的離子的質荷比。離子上的電荷由基本電荷單位的整數表示，而質荷比則表示為道爾頓/基本電荷單位。結果以生成的質譜圖形式表示。質譜圖是離子強度作為質荷比的函式的圖形。

新術語

道爾頓

用於表示原子、分子或核粒子的質量的質量單位，等於最豐富碳同位素原子質量的 1/12。 (http://www.merriam-webster.com/medical/dalton )

電暈

高壓下在電導體表面附近出現的微弱輝光。 (http://www.merriam-webster.com/dictionary/corona )

質譜圖

根據離子的質量電荷比分離的氣態離子流譜圖（http://www.merriam-webster.com/dictionary/mass%20spectrum）。

闡明

透過解釋或分析使某事物清晰明瞭（http://www.merriam-webster.com/dictionary/elucidate）。

同位素

指同一化學元素的兩種或多種原子，其原子序數相同，化學性質幾乎相同，但原子質量或質量數不同，物理性質也不同（http://www.merriam-webster.com/dictionary/isotopes）。

課程相關性

這如何與蛋白質組學課程相關？

蛋白質組學是蛋白質的研究，其定義是在不同條件下對蛋白質組進行定性和定量比較，以進一步揭示生物過程。質譜法可以用來研究生物體的組成部分以及它們如何產生其個體功能。