蛋白質組學/蛋白質分離- 電泳/二維聚丙烯醯胺凝膠電泳(2D-PAGE)

2D-PAGE是一種凝膠電泳形式，其中樣品中蛋白質的分離和鑑定是透過在兩個相互垂直的維度（正交）上的位移來完成的。該技術也用於比較兩個或多個樣品，以找出其蛋白質表達的差異。

分離基礎

在這種技術中，蛋白質透過兩種不同的理化性質進行分離。在第一維中，蛋白質或多肽根據其淨電荷透過等電聚焦進行分離，在第二維中，它們根據其分子量透過電泳進行分離。由於兩種分子不太可能在兩種性質上都相似，因此在二維電泳中，分子比一維電泳更有效地分離。

樣品製備

樣品製備的目的是使最大數量的蛋白質溶解並保持其在整個過程中的溶解性。樣品的材料應仔細收集、速凍並在液氮中存在蛋白酶抑制劑的情況下研磨。從來源材料中提取蛋白質後，它們透過用致變劑、去垢劑和還原劑溶解和變性。尿素和硫脲是致變劑，用於破壞樣品蛋白質中的氫鍵。非離子去垢劑用於破壞疏水相互作用。CHAPS、Triton X-100、磺基甜菜鹼SB3-10和醯胺磺基甜菜鹼是IEF相容的新增劑。二硫鍵透過還原劑二硫蘇糖醇(DTT)、二硫赤蘚醇和三丁基膦(TBP)還原為巰基。

順序提取用於根據蛋白質的溶解性對蛋白質進行分類。這是預分餾以富集低丰度蛋白質的一個例子。蛋白質被順序提取到溶解能力不斷增加的致變劑/去垢劑溶液中。首先，蛋白質用含水緩衝液處理，從該提取中剩餘的不可溶蛋白質用尿素/CHAPS/TBP處理，然後從該步驟中剩餘的不可溶蛋白質用尿素/硫脲/CHAPS/SB 3-10/TBP處理。然後進行2D-PAGE以分離每個上清液中的蛋白質。從最後一步提取中剩餘的不可溶物質可以吸收在SDS-PAGE樣品溶液中，並在一維凝膠中執行。

等電聚焦(IEF)

在IEF中，蛋白質根據其等電點(pI)在pH梯度中透過電泳分離。在凝膠中產生pH梯度，並在凝膠上施加電勢。在除了等電點以外的所有pH值下，蛋白質都帶電。如果它們帶正電，它們將移動到凝膠的負極端；如果它們帶負電，它們將移動到凝膠的正極端。在其等電點，由於蛋白質分子不帶淨電荷，因此它會積累或聚焦成一個尖銳的帶。

固定化pH梯度(IPG)和IEF執行

固定化pH梯度用於IEF，因為固定pH梯度在非常高的電壓下在長時間執行中保持穩定。IPG的pH梯度是透過將緩衝化合物共價結合到聚丙烯醯胺凝膠中產生的。IPG是帶有塑膠支撐層的鑄造條，可在不同的pH範圍內和長度範圍內商業化獲得。它們提供高解析度、高重現性，並允許高蛋白負載。等電聚焦在用於提取或溶解蛋白質的相同溶液中進行。帶有蛋白質樣品的IPG條必須在覆水/樣品緩衝液中覆水，在覆水過程中將蛋白質樣品載入到條中。覆水可以是主動的或被動的。為了載入更大的蛋白質，在低電壓下施加主動覆水。在IEF電池中執行後，蛋白質根據其等電點聚焦成條帶。聚焦條可以冷凍儲存。

SDS-PAGE

IPG凝膠條平衡

聚焦的IPG條中的蛋白質不帶電，因為它們處於其pI，因此它們不會移動到SDS-PAGE凝膠中。因此，這些條用SDS（十二烷基硫酸鈉）處理，SDS是一種陰離子去垢劑，透過破壞二硫鍵使蛋白質變性，並根據蛋白質的質量賦予每個蛋白質負電荷。如果沒有SDS，具有相似分子量的不同蛋白質由於摺疊的不同而會以不同的方式遷移，因為摺疊模式的差異會導致一些蛋白質比其他蛋白質更好地透過凝膠基質。SDS線性化蛋白質，使它們可以嚴格地按分子量分離。SDS與蛋白質的結合比例大約為每1.0克蛋白質1.4克SDS（儘管結合比例可以從1.1-2.2克SDS/克蛋白質不等），這使得大多數蛋白質具有近似均勻的質量/電荷比，因此可以透過凝膠的遷移距離可以假定與蛋白質的大小直接相關。蛋白質可以進一步用還原劑處理，如二硫蘇糖醇(DTT)或TRP(三丁基膦)以破壞任何重新形成的二硫鍵，然後用碘乙醯胺烷基化以防止二硫鍵的重新形成。可以將跟蹤染料如溴酚藍新增到蛋白質溶液中，以跟蹤蛋白質溶液在電泳執行過程中透過凝膠的程序。

SDS-PAGE執行

平衡的IPG條被放置在SDS-PAGE凝膠頂部，浸沒在合適的緩衝液中，並用瓊脂糖凝膠固定到位。在凝膠上施加電流，導致帶負電的蛋白質從凝膠中移出，並穿過凝膠遷移。根據蛋白質的大小，每種蛋白質都會以不同的方式穿過凝膠基質。較小的蛋白質會沿著凝膠遷移得更遠，而較大的蛋白質會停留在更靠近起點的位置。蛋白質大致根據大小，因此根據分子量分離。通常，將已知分子量的“標記蛋白質”在凝膠中的單獨泳道中執行，以便校準凝膠並透過比較相對於標記蛋白質的遷移距離來確定未知蛋白質的重量。

視覺化

電泳後，凝膠會被染色以觀察分離的蛋白質。常用的染色劑有考馬斯亮藍、SYPRO Ruby 或銀染。不同的蛋白質會在凝膠中顯示為不同的點。考馬斯亮藍或 SYPRO Ruby 與質譜法相容。考馬斯亮藍的檢測限約為每個點 10ng 蛋白質，而凝膠點的影像可以透過在可見光下工作的掃描密度計捕獲 [[1]]。SYPRO Ruby 可以檢測到每個點 1ng 蛋白質，由於它具有熒光性，因此可以透過熒光成像儀觀察到點。銀染可以檢測到包含少於 1ng 蛋白質的點，是最靈敏的非放射性蛋白質視覺化方法。用於影像捕獲的雷射裝置適用於熒光染色凝膠。

分析

這些影像可以透過影像分析軟體進行進一步分析。這些軟體可以對蛋白質點進行量化、匹配影像並比較相關凝膠中對應點的強度、準備凝膠資料報告、去除背景模式，並將影像資訊整合到資料庫中。或者，可以從凝膠中獲取分離的蛋白質，並透過質譜法進行蛋白質鑑定分析。二維電泳可用於研究差異蛋白質表達，方法是比較用穩定同位素或熒光染料標記的二維電泳凝膠樣本的影像。

優點和缺點

使用二維電泳，可以在一次執行中分析 100 到 1000 多種多肽。蛋白質可以從點中分離出來，得到純的形式。可以對點進行量化，也可以透過質譜法進行分析。在這種方法中，多肽可以被抗體探測，也可以檢測其翻譯後修飾。缺點可能包括大量樣本處理、重現性差、難以分離低丰度蛋白質、酸性和鹼性蛋白質、非常大或非常小的蛋白質以及疏水性蛋白質。此外，該方法無法實現高通量分析的自動化。二維電泳的動態範圍有限。

參考文獻

Beranova-Giorgianni, S. (2003) 利用二維凝膠電泳和質譜法進行蛋白質組分析：優勢和侷限性。TrAC 趨勢分析化學 22(5), 273-281.[[2]]
Stephen J. Fey* 和 Peter Mose Larsen (2001) 二維還是非二維。化學生物學現狀 2001, 5:26–33.[[3]]
Wayne F. Patton*，Birte Schulenberg 和 Thomas H Steinberg (2002) 二維凝膠電泳；比 ICAT 更好？生物技術現狀，13:321–328.[[4]]
David E. Garfin (2003) 二維凝膠電泳：概述。趨勢分析化學，第 22 卷，第 5 期
http://www.weihenstephan.de/blm/deg/manual/manualwork2html02test.htm
http://www.aber.ac.uk/parasitology/Proteome/Tut_2D.html