蛋白質組學/蛋白質分離 - 離心/密度梯度離心
密度梯度在離心分離顆粒混合物以及亞細胞器和生物大分子的純化中已變得幾乎是常規操作。密度梯度方法的基本思想是，將待分離的顆粒混合物置於垂直液體柱的表面，該液體柱的密度從上到下逐漸增加，然後進行離心。儘管懸浮液中的顆粒都比梯度頂部的液體密度大，但樣品的平均密度（即顆粒加上懸浮液）較低；只有在這種情況下，樣品區才能由密度梯度的頂部支撐。密度梯度離心的兩種主要型別是速率區帶分離和等密度分離。
在速率區帶分離中，顆粒根據其大小和質量進行分離。這意味著它們根據這些特性在梯度中遷移 - 如果將它們作為薄層鋪在梯度的頂部，這將使它們分離成不同的區域或條帶。這對於分離具有相同或非常相似密度但大小或質量不同的顆粒很有用：在確定顆粒在給定時間內遷移到哪裡時，大小比密度更強的判別因素，因為顆粒在重力場中的沉降速率或速度與密度差成正比，但取決於直徑的平方。
許多蛋白質和其他生物大分子，如抗體和病毒顆粒，都是以這種方式分離的。
通常情況下，速率區帶分離是動態的而不是靜態的：也就是說，如果離心時間足夠長，所有區域最終都會變成一個沉澱物沉積在管子的底部。如果管中最大的密度（例如，10-50%（w/v）蔗糖梯度為 1.04 至 1.23 g/cm3）高於一個特定顆粒的密度，但低於其他正在分離的顆粒，則也可以將速率區帶分離和密度分離相結合。
在等密度分離中，顆粒穿過溶劑梯度，直到到達其浮力密度等於梯度密度的點。這被稱為等密度點或等密度位置。一旦顆粒到達其等密度點，它們將不再在梯度中移動，無論離心機繼續執行多長時間。這種梯度的一個例子是氯化銫濃度梯度。例如，10%（w/v）溶液的密度為 1.08 g/cm3，50%（w/v）溶液的密度增加到 1.58 g/cm3。它和其他重金屬鹽存在一些毒性和產生非常強的滲透壓的問題，以及化學影響某些生物大分子。還有其他更惰性的材料更適合等密度甚至速率區帶分離，例如碘克沙醇：這是一種非離子聚合物，具有非常低的滲透壓，並且能夠像重金屬鹽一樣自形成梯度。
選擇嘗試基於速率分離顆粒還是透過等密度帶分離應考慮以下幾點
- 對於像細胞器這樣的較大顆粒，速率區帶執行的持續時間比等密度執行短得多。當顆粒的長期活力或穩定性存疑時，這可能是一個重要的考慮因素。
- 速率區帶執行通常在比等密度執行更淺的密度梯度中進行。這種條件可以證明對滲透活性顆粒的損害較小。
- 速率區帶執行通常使用比等密度執行中使用的RFC更低的 RFC 進行。對於某些特別脆弱的顆粒，沉降過程中降低的流體動力剪下力可能有助於維持顆粒的完整性。
- 離心時間的長短在等密度執行中並不像在速率區帶執行中那麼關鍵。為了獲得等密度帶，需要一定的最小離心量，但如果樣品鋪在梯度的頂部，則超過此時間的延長離心時間不會過多改變結果。
- 一般來說，與速率離心相比，等密度梯度離心可以分離更多的顆粒。這是因為用於等密度執行的密度梯度更陡峭，並且更穩定地支援更大的樣品量。
密度梯度不僅用於常規轉子的離心管中的顆粒分離，還用於特殊用途的儀器，如區域轉子、連續流轉子和固定裝置。密度梯度製備的基本原理在幾乎所有應用中都是相同的，但目前討論將集中在管中梯度的生成上。根據製備方法，密度梯度可以細分為兩大類：階梯梯度和連續梯度。
階梯梯度是透過在離心管中依次分層不同密度的溶液，然後將待分餾的樣品分層在最後一層“階梯”上製備的。階梯梯度有時在密度梯度離心中很有用，因為持續存在的急劇密度階梯可以用作顆粒在離心中沉降的表面。這導致在每個階梯處形成離散的顆粒層。
階梯梯度的生產不需要特殊的密度梯度生成裝置。梯度可以透過小心地將一層一層地分層在離心管中構建，從最密的層開始，使用移液器。或者，梯度可以透過使用細管將每一層沉積在離心管的底部開始形成，從密度最小的層開始。
連續密度梯度是指密度從一個極限或極端到另一個極限平滑且連續變化的梯度。可以透過允許足夠的時間讓擴散來平滑階梯來從階梯梯度生成這種梯度，但連續梯度通常是透過使用稱為梯度發生器或梯度引擎的特殊裝置直接製備的。
對於大多數生物學工作，用於產生密度梯度的理想溶質應滿足以下標準
- 溶質應在水性介質中具有足夠的溶解度以產生所需的密度範圍。
- 溶質的溶解不應導致在所需密度範圍內產生高粘度的溶液。粘性溶液對梯度發生器提出了特殊的混合問題，並且處理起來也比較困難。此外，顆粒的沉降速率與周圍介質的粘度成反比下降。
- 溶質在所需的密度梯度範圍內不應產生過高的滲透壓。當這些顆粒透過密度梯度沉降時，如果周圍介質的滲透壓發生顯著變化，則完整細胞、膜封閉的亞細胞器甚至大分子的大小、形狀和密度都會發生改變。
- 梯度溶質的溶液應可調節至與待分離顆粒相容的pH值和離子強度。
- 溶質不應與待分離的顆粒發生反應，也不應干擾收集餾分的分析方法。
- 梯度溶質的溶液應表現出一種特性，該特性可以方便地用作濃度或梯度密度的量度。
- 溶質應易於從收集的梯度餾分中去除（如果需要或需要）。
- 溶質在所需數量下應價格合理。
離心結束後，密度梯度和纏結的顆粒區域通常從離心管（或轉子）中取出並收集為一系列餾分。這可以透過多種方式實現。最古老和最簡單的方法之一是刺穿每個離心管的底部，讓內容物緩慢滴出。也可以透過小心地將一根狹窄的套管降低到管子的底部，並使用蠕動泵抽出梯度來去除梯度。在這兩種方法中，梯度都以高密度端先離開管子，因此分離的顆粒按沉降速率或密度遞減的順序收集。第三種選擇是在目標物質在梯度中的位置刺穿管子並手動提取。有關此內容的詳細說明，請參閱http://people.rit.edu/rhrsbi/GEPages/LabManualPDF5ed/23%20Plasmid%20Prep.pdf中的協議。下圖演示了質粒DNA餾分收集過程；但是，可以看出這很容易應用於蛋白質餾分。
由於溶液的密度是其質量與體積之比，因此在收集的梯度的連續等分試樣中測量這兩個引數可以揭示梯度的曲線。但是，這種方法很笨拙且耗時，很少與密度梯度離心結合使用。相反，測定從梯度的不同區域採集的小液滴的折射率，並從折射率與密度相關的表格或曲線中獲得相應的密度。
當光從一種介質穿過另一種介質時，光速會發生變化。如果光以90度以外的任何角度穿過兩種介質之間的介面，則光的方向也會發生變化。物質的折射率是衡量其彎曲光的能力的指標，並且與物質的密度有關。有關此主題的更多詳細資訊，請參閱維基百科上的斯涅爾定律。
下一節：差速離心
- "離心基礎" 科爾帕默技術圖書館（經賽默飛世爾科技許可釋出）。
- "BioChemika Ultra：密度梯度" 西格瑪奧德里奇公司。
- Moedersheim，E. 等。"使用密度梯度方法的轉子尾流視覺化" 旋翼機空氣動力學小組。
- Rothman，R。"基因工程實驗手冊：實驗6 - 透過氯化銫密度梯度離心法大規模純化質粒pRIT4501和pRIT4502" 羅切斯特理工學院。