感覺系統/視覺系統/體內成像

胚胎皮層的超高解析度鈣成像。

艾倫研究院大資料

大腦中大約有1000億個神經元。大腦內部的複雜性是無與倫比的。舉個例子，當向被動小鼠展示變化的影像時，會出現興奮性神經元、抑制性神經元、預測影像變化時活動增加的神經元，以及當預測的影像變化沒有發生時活動持續累積的神經元。隨著資訊編碼方案這種維度，必須在後續步驟中進行整合以形成我們完整的視覺感知，神經科學界的一個關鍵目標是產生大資料。為了成功地在非常大的規模上生成感覺處理的體內資料，艾倫腦科學研究所等機構在過去十年裡專注於自動化資料生產和收集的流程。截至目前，艾倫研究院已經發布了大量來自視覺編碼流程生成的資料，並且目前正在透過他們的視覺行為流程進行新的資料生產方法。

艾倫研究院是透過標準化程式生成大量感覺處理資料的成功成像策略實施的一個關鍵例子。艾倫研究院的流程包括七個步驟，工程師、光學技術員和外科技術員團隊協作以確保其順利執行。到目前為止，這種學科和思想的整合已經產生了1900種細胞型別的形態學、基因活動、電生理學、鈣成像和拓撲學資料。所有資料都是使用尖端的成像技術收集的，這些技術使長期和高靈敏度的記錄成為可能。

實驗設定

在任何體內成像過程中實現高解析度都需要一些獨特的啟發式方法。在進行任何成像之前，小鼠必須進行手術以植入頭部固定架。在手術過程中，外科醫生會移除一小部分顱骨，然後用一塊附著在頭部固定架上的玻璃顱窗覆蓋（圖 1）。頭部固定架的目的是雙重的：（1）它允許在成像步驟中觀察熒光變化，以及（2）它可以鉤在頭部固定板上，確保頭部固定並在成像過程中獲得最高解析度。由於這完全限制了頭部並增加了壓力的可能性，因此在小鼠下方放置了一個旋轉盤，以允許緩解壓力的跑步活動（圖 2）。這種活動被監測並輸入到資料輸出中，作為研究人員進行額外分析的技術。記錄的其他資料測量包括瞳孔擴張的影片評估、身體位置、跑步資料和眼動追蹤，在後期評估中以紅十字形式顯示在與小鼠注視點相對應的影像螢幕上。過去實驗資料顯示，與人類相比，小鼠在暴露於新影像時眼部運動明顯少，因為它們中央凹的視力解析度與周邊視力解析度大致相同。

視覺編碼流程

艾倫腦觀測站視覺編碼流程包括（7）個步驟，如下所述。

1. Cre 驅動 x GCaMP6 報告基因：轉基因小鼠品系經過基因工程改造，可以表達 GCaMP6 遺傳編碼的鈣指示劑 (GECI)。GECI 具有區域性表達，具體取決於其編碼的特定細胞系或功能區域。因此，艾倫研究院的遺傳學家透過選擇基因、透過插入 GCaMP6 對基因進行編輯，並驅動基因表達，有效地突出了大腦以進行進一步的成像步驟。
2. 手術：小鼠進行頭部固定架植入手術。如果頭部固定架的穩定性被認為不適合雙光子鈣成像，則規定進行第二次手術以在頭部固定架上塗抹額外的 Metabond。
3. 內在訊號成像 (ISI)：ISI 是衡量血流動力學反應的工具，即與氧合水平直接相關的血紅蛋白反射率。艾倫研究院的科學家在這一步中使用 ISI 來對映功能上定義的皮層區域和視網膜地形圖。小鼠暴露於黑白色棋盤格的視覺刺激，在整個視野尺度上沿基線軸進行所有方向上的平移。然後，使用離散傅立葉變換根據輸入刺激頻率對視覺刺激的相點陣圖進行計算。相位資訊對於將視覺刺激對映到 V1 等皮層區域很有用。方位角和仰角圖也透過分別沿方位角/仰角投影來獲取，因此關於相對於中心點的方位角/仰角距離的資訊得以保留。符號圖是透過對相點陣圖的方位角和仰角梯度進行正弦運算而生成的。為了標準化這種技術，將每隻新小鼠與之前定義的皮層視覺區域的通用模型進行比較，該模型基於 35 個組合符號圖（圖 4）。自動化過程使用每個已定義視覺區域的大小、相位、位置和空間關係資訊，最佳化新圖與舊模型的符號圖擬合。血管也用於確定視覺皮質邊界正確的位置。這將產生一個通用的座標框架 (CCF) 對映，這在接下來的雙光子成像步驟中非常有用。

4. 習慣化：小鼠在十天的時間內適應實驗裝置，被動地觀看影像以減少壓力並允許適應。在此期間，小鼠會暴露於各種刺激影像。透過鼻子隆起、眼睛周圍的過度分泌以及/或異常姿勢來監測壓力。
5. 體內雙光子鈣成像：硬體包括尼康 A[1]R MP+ 雙光子成像顯微鏡和 910 奈米雷射器。由於畫素之間的熒光洩漏，即熒光從第一個成像畫素傳播到下一個畫素，對資料進行成像後應用反捲積計算。卷積方程在下面描述

${\begin{array}{lcl}{\tilde {x}}&=&{\tilde {G}}{\tilde {y}}\\{\tilde {G}}&=&{\frac {1}{\tilde {H}}}({\frac {|{\tilde {H}}|^{2}}{|{\tilde {H}}|^{2}+\lambda \Lambda {\tilde {y}}}})\end{array}}$

其中符號表示

${\begin{array}{lcl}H&=&{\text{leakage filter}}={\text{pixel series (ym)/ time series (yT)}}\\{\tilde {H}}&=&{\text{Fourier transform of H}}\\{\tilde {y}}&=&{\text{pixel series * }}{\tilde {H}}{\text{ + noise}}\\\lambda &=&.[1]={\text{smoothness weight, empirically tested}}\\\Lambda &=&{\text{Laplacian Operator}}\end{array}}$

該公式考慮了洩漏的不均勻性，給定邊緣洩漏較少而中心洩漏較大的經驗發現。

雷射功率在最大功率和避免畫素飽和這兩個約束之間進行了最佳化。在約 90 分鐘的實驗過程中，會生成約 0.1 微米的影像 z 軸堆疊。

還使用各種過濾器執行感興趣區域 (ROI) 過濾，以建立活動細胞與背景噪聲的二值化掩碼。沒有實現資料減少技術，而是先應用帶通濾波，然後從透過低通濾波器（圖 3）的自身中減去完整影像。進一步的分析包括分類分析，使用先前資料集樣本中發現的物體形狀、大小和麵積等引數。一旦得出 ROI，影像就可以被分割成其細胞物體和背景，並且只有這些細胞物體內的熒光被傳遞到光電倍增管 (PMT) 以進行累加。

1. 內在訊號成像：驗證功能定義的視覺皮層區域是否仍以 CCF 為中心。
2. 序列雙光子斷層掃描：對小鼠大腦進行組織成像，以推斷所有皮層區域的大腦影像的 3D 體積並檢測結構異質性。

圖 4：ISI 影像生成和處理

方位角和仰角測量值的視覺化。

有關視覺編碼管道的全部資訊在 Allen 研究所白皮書 中詳細解釋。

鈣指示劑

圖 5：神經元動作電位的關鍵部分是鈣離子的內流。這些鈣離子導致神經遞質囊泡向膜遷移，最終導致透過神經遞質釋放到突觸間隙的化學傳遞。

鈣動力學與透過神經元傳導的動作電位緊密耦合。動作電位，廣義上定義為快速膜去極化和隨之而來的超極化事件序列，是由離子​​和離子通道產生的。電壓門控離子通道是鈉離子和鉀離子的“司機”，透過正反饋機制隨著膜電壓電位的增加而開啟。因此，離子電位的事件序列通常是不可變的：在一定量的鈉離子內流超過閾值後，所有通道最終都會開啟，膜電位將達到與細胞發射相關的最大值。鈉電壓門控通道透過與較慢的鉀通道開啟同時關閉來結束動作電位，因此鉀離子可以流出並恢復靜息狀態的電化學梯度。然而，這種電通訊僅限於單個神經元的膜，因為神經元沒有物理連線，因此神經元之間的間隙連線充當電短路。化學突觸傳遞是將訊號傳遞到間隙連線之間所必需的。神經遞質充當此角色，並且與鈣動力學內在地相關。在靜息狀態的神經元中，神經遞質被儲存在突觸前活性區的囊泡中。當發射動作電位時，它會開啟鈣離子通道，並且當動作電位繼續時，進入的鈣離子會流入神經元（圖 5）。這些離子觸發充滿神經遞質的囊泡向細胞表面的遷移，在那裡它們釋放其內容。因此，鈣離子是動作電位的代表，監控它們的動力學提供了對神經元活動的基本見解。還值得注意的是，鈣離子是神經可塑性和神經發育 的重要因素，神經元在生命早期。

鈣指示劑具有多方面的用途 - 將鈣與熒光聯絡起來，並將這種聯絡限制在區域性區域。鈣指示劑有兩個領域：化學指示劑和遺傳編碼的鈣指示劑 (GECI)。化學指示劑與鈣離子螯合，通常透過載入的鈣染料 引入特定神經元群體。這種策略有幾個缺點：（1）對相同神經元群體的長期成像需要反覆注射鈣染料，並且容易出現人為錯誤，以及（2）記錄的特異性僅限於空間位置，而不是細胞型別或亞細胞隔室。GECI 在檢測鈣動力學的比較敏感水平的同時，避開了這些缺點。由於它們是遺傳編碼的，因此它們可以用於慢性成像研究，這具有巨大的優勢。在來自一隻小鼠的單個大腦區域生成長期一致的資訊對於產生大資料至關重要。目前存在兩類額外的 GECI：（1）變色龍蛋白，以及（2）GFP 熒光蛋白。變色龍在與鈣結合後會發生構象變化並在不同的波長下輻射。另一方面，GFP 熒光蛋白的特點是 Ca2+ 依賴性蛋白，該蛋白被編碼為插入到 GFP 熒光蛋白遺傳密碼中的序列。GFP 熒光蛋白 GCaMP6 用於 Allen 視覺編碼管道 中。

成像顯微鏡技術

圖 6：雙光子鈣成像中 940-950 nm 的 GCaMP 遺傳編碼的鈣指示劑熒光。

在選擇熒光表達的報告分子後，必須決定成像技術。鈣熒光成像有兩個主要類別：（1）熒光顯微鏡，以及（2）雙光子鈣成像。前者，熒光成像，利用光散射效應。它可以用於對固定組織的薄切片進行成像，並記錄用電荷耦合器件 (CCD) 陣列照射的雷射照射的表面的發射光。但是，由於這種基於光散射的測量，它缺乏空間特異性和深度，光散射的測量會受到來自蛋白質和其他小分子在超過 100 微米的深度處的訊號噪聲的非平凡影響。雙光子鈣成像很有用，因為它克服了這些限制，實現了超過 100 微米的深度並增強了空間特異性（圖 6）。

雙光子鈣成像與落射熒光之間的差異是透過熒光蛋白進行的：在雙光子鈣成像中，熒光蛋白經過蛋白質工程設計，需要兩倍的波長才能被激發（約 1240 nm 與約 620 nm），將其激發範圍提高到紅外光譜。因此，激發是透過兩個同時到達某個位置的光子實現的，即在兩個雷射的交叉點，解析度約為微米。然後，透過使用光電倍增管 (PMT) 測量發射的光子來獲得每微米步的成像資訊。該光子訊號被轉換為電壓，在資料收集時間段內累加，並分配給最終影像中對應於該位置的畫素。

成像與電生理學

與電生理學相比，成像技術是一種相對較新的技術，由於記錄資訊的性質不同，在許多方面存在對比。成像記錄具有不同的空間焦點，因為它在 z 深度生成 x-y 維度資訊，而大多數電極相關的電生理技術則生成 z 維度深度資訊。研究人員必須根據其實驗目標，權衡這種差異。每種技術都存在無法完全克服的內在缺點。成像記錄幾乎總是間接測量，如上面詳細介紹的鈣成像方法。雖然鈣是動作電位傳播的結果，但它並不是背後的驅動力。鈣成像也無法測量亞閾值電壓，因為它僅限於動作電位後鈣流入的觸發。然而，鈣成像通常對機制的侵入性較小，範圍更廣，並且可以生成神經活動 z 堆疊層的體內資料。這允許同時進行成像和行為資料收集，這將在下面討論。它還考慮了鈣指示劑位置的生化資訊，這與電生理記錄不同，後者僅限於尖峰活動或複合場電位的電訊號資訊。

每個實驗中都需要考慮的一個重要因素是信噪比，這在成像和電生理記錄中來源不同。差異在於成像所需的訊號轉導，其中電訊號或化學訊號被轉換為光子，透過熒光變化與原始熒光的差值進行測量。電生理記錄（如膜片鉗技術）會受到儀器輔助因素的抑制。另一方面，成像中的噪聲來源是離散光子，當檢測到相對較低的光子水平時，這些光子會導致散粒噪聲，導致在由產生的平均訊號周圍出現大的波動。可以透過增加表達熒光的報告分子的濃度來降低這種散粒噪聲，只要不擾亂生物系統。

視覺行為管道

感覺處理與意識密切相關，因為感覺處理可能會受到自上而下的影響，如腦狀態。例如，不同神經元對結構相似的影像的反應不同，這取決於對影像中發生事件的意識和預測。視野中的可識別物體將引發沿腹側處理流的一系列動作電位。對未實現的視覺刺激的預期會導致某些神經元中鈣流入增加，即放電。在瑞士溫帶氣候中通勤時，從遠處觀察到的小動物通常會被識別為貓或松鼠，而不是考拉。

神經元將前饋和反饋資訊整合到它們的特性中，因此，如果不嘗試理解更廣泛的背景影響，如意識，我們就無法完全理解視覺編碼中的神經活動。鑑於此資訊，為實驗動物提供某種表達意識的方式非常重要。這種溝通對人類參與者來說很容易，但需要對小鼠和其他動物進行行為訓練。

艾倫研究所透過視覺行為管道實施了行為分析。視覺行為管道透過與視覺編碼管道相同的步驟序列進行，只是在適應後增加了行為訓練步驟。

影像檢測的行為訓練分四個步驟進行，最終目標是透過操作性條件反射訓練小鼠對影像變化做出反應。如果表現出正確的行為，操作性條件反射將獎勵獎勵。在適應後，自由獎勵階段引入了舔食口。第三階段是靜態光柵視覺刺激和獎勵階段。因此，在這個階段，手頭的任務是識別靜態光柵旋轉（從 0 度到 90 度），並且在小鼠經過適當訓練後通常會獲得很高的準確率。在這個階段的初始階段，通常會觀察到過度或探索性的舔食，這表明小鼠尚未經過適當訓練。

根據影像檢測試驗和觀察到的行為反應的組合，可以觀察到四種類型的試驗。命中試驗是訓練中預期結果的“前進”試驗與訓練的舔食反應的組合，並會得到獎勵。正確拒絕試驗也是預期結果，發生在小鼠對捕捉試驗沒有舔食時。但是，有兩種型別的錯誤反應：漏失試驗 - “前進”試驗，沒有舔食 - 以及假警報試驗 - “捕捉”試驗，舔食。

透過這種實驗訓練設定，小鼠學會在影像檢測任務中做出反應，使資料分析人員能夠將神經活動、影像序列和透過行為反應測量的更高階編碼表示相關聯。然而，實驗的架構產生了幾個潛在的缺陷，艾倫研究所過去已經控制了這些缺陷。首先，舔食口的位置出乎意料地相關。舔食口的位置目前是使用座標系調整，然後記錄每個小鼠的位置。當觀察到舔食反應與舔食口放置相關的模式時，人們意識到這種放置很重要。當舔食口太近或太遠時，小鼠明顯地權衡了用水支付與舔食的努力之間的成本函式。因此，當舔食口太近時，觀察到過度舔食，而當太遠時，舔食受到阻礙。這種實驗設定的另一個相關特徵體現在影像呈現背後的演算法中。影像變化不能由定時影像序列產生，否則小鼠會學會預測它。因此，必須引入隨機性的因素來防止小鼠 - 及其神經元 - 預測影像變化。