結構生物化學/利用祖先基因重建分析蛋白質結構和功能
瞭解蛋白質序列如何決定結構和功能，以及瞭解產生現存蛋白質的多種結構和功能的過程，需要了解蛋白質序列可能空間中結構和功能的分佈情況。然而，由於可能的序列數量巨大，以及實驗生成和研究它們所需的時間，因此表徵這種分佈可能非常困難。解決此問題的一個方法是分析進化記錄。進化是一個巨大的實驗，涉及蛋白質結構的多樣化和最佳化。這個巨大實驗的結果儲存在現代蛋白質家族的序列、結構和功能中。對這些家族的進化分析可以為蛋白質序列空間的性質以及蛋白質結構和功能的決定因素提供關鍵見解。
研究蛋白質家族的一種方法是使用基於序列或結構的分析來識別不同家族成員之間的候選氨基酸差異。之後可以透過使用定點誘變在家族成員之間交換這些殘基來測試它們的功能作用。這被稱為“水平”方法，它透過交換殘基來識別對一種功能重要的殘基，因為交換會使蛋白質失活或無法發揮功能。然而，這種方法很少識別出足以將一種蛋白質的功能轉換為另一種蛋白質的功能的殘基集。蛋白質功能隨著時間的推移而進化，或者垂直地，在祖先蛋白譜系中積累的突變而發生。另一方面，現代蛋白質的水平比較僅涉及進化樹的頂端。水平方法有兩個主要缺陷。首先，它效率低下，因為在感興趣的功能沒有改變的時間間隔內，可能積累了許多功能無關的序列差異。其次，譜系特異性序列變化可能會導致上位性，或者突變之間的相互依賴性，導致單一變化在不同的蛋白質家族成員中產生不同的影響。
一種明確的系統發育方法來研究蛋白質家族內的功能多樣性可以解決這些問題。垂直策略將解決發生在功能多樣化發生的家族樹分支上的突變。這種策略效率更高，因為只需要調查在有限的進化時間段內發生的突變。此外，這種垂直策略可以透過使用實際發生序列變化的蛋白質背景來避免上位性相互作用的影響。垂直策略甚至會識別限制性和允許性上位性突變。
研究家族分支的進化可能很困難，因為它需要訪問分支兩端的節點。然而，祖先序列重建 (ASR)，一種研究分子進化的新策略，可以解決這個問題。ASR 是一項成熟的技術，已被用於研究許多蛋白質家族，包括 GFP 樣蛋白質、類固醇受體、視蛋白等。ASR 首先從現存蛋白質序列的比對中推斷出祖先序列。系統發育樹上任何祖先節點的最大似然序列是產生現代蛋白質中所有序列資料的機率最高的序列。一旦發現祖先蛋白質序列，就可以合成編碼它的 DNA 分子。這允許祖先蛋白質被實驗表達和表徵。以下案例研究證明了 ASR 研究在定量分析決定功能的相互作用、揭示功能背後的多個氨基酸以及確定上位性在塑造蛋白質進化中的作用方面的有效性。
視蛋白：量化功能相互作用
視蛋白的研究表明了使用 ASR 來研究功能轉換突變的影響的好處。視蛋白是 G 蛋白偶聯受體家族，它們在脊椎動物視覺系統中吸收光。所有視蛋白都使用相同的共價連線的生色團。然而，每個視蛋白都有不同的最大吸收波長。由於最大吸收波長序列決定因素的複雜性，現代視蛋白的比較研究難以解釋。然而，研究人員能夠使用 ASR 來解開這些相互作用，併產生了普遍適用於整個家族的結果。
GFP 樣蛋白質
Mikhail Matz 的實驗室對來自石珊瑚的 GFP 樣蛋白質的工作證明了 ASR 在識別這些殘基方面的有效使用。透過使用 ASR 來表徵整個家族的古代序列，Matz 及其同事發現，祖先的 Faviina 中的 GFP 樣蛋白質在綠色中發出熒光，隨後是各種其他顏色。Matz 及其同事隨後決定確定導致這種綠色祖先在巨大星珊瑚 Montastrea cavernosa 中進化出紅色熒光的突變。透過使用 ASR，他們能夠識別出使用水平方法無法識別的突變。
這些 ASR 案例研究表明，ASR 有望為塑造蛋白質進化的物理化學決定因素以及蛋白質結構的歷史決定因素提供新的見解。此外，ASR 在機械生物化學和進化生物學之間架起了一座橋樑，這兩門學科在很大程度上是分開的。
- 結構生物學現狀 20 卷，3 期，2010 年 6 月，第 360-366 頁