結構生物化學/生物成像
在光學顯微鏡中,玻璃透鏡用於將光束聚焦到被研究的樣品上。透過樣品的光線然後被其他透鏡聚焦以產生放大影像。標準(明場)光學顯微鏡是目前使用最廣泛的顯微鏡技術,它使用複式顯微鏡。樣品從顯微鏡底座的燈泡照亮,光線被聚光鏡聚焦到樣品平面上。透過樣品的光線被物鏡收集並聚焦到其焦平面上,從而產生放大影像。此影像被目鏡進一步放大,所達到的總放大倍數是各個透鏡放大倍數的總和。為了提高複式顯微鏡的解析度,樣品經常被覆蓋在浸入油中,物鏡被放置在浸入油中。使用可見光的光學顯微鏡的解析度極限約為 0.2*10-12m。
在熒光顯微鏡中,光學顯微鏡被改造成檢測熒光化合物發出的光,該熒光化合物被用來選擇性地染色細胞內的組分。如果一種化學物質在一種波長(激發波長)下吸收光,然後在較長的波長(發射波長)下發射光,則稱該化學物質為熒光物質。熒光顯微鏡中常用的兩種化合物是羅丹明和德克薩斯紅,它們發射紅色光,以及熒光素,它發射綠色光。首先,將針對目標抗原(稱為初級抗體)的抗體新增到樣品中。熒光化合物被化學偶聯到識別初級抗體的次級抗體上。然後將熒游標記的次級抗體新增到組織切片或透化細胞中,用激發波長的光照射樣品。然後可以觀察到抗體結合的樣品中的結構。熒光顯微鏡也可以應用於活細胞,這使得能夠隨著時間的推移跟蹤細胞和細胞內結構的運動。
發現了在水母維多利亞水母中發現的一種天然熒光蛋白。在這個由 238 個氨基酸組成的蛋白質中,稱為綠色熒光蛋白 (GFP),某些氨基酸側鏈自發環化形成綠色熒光的生色團。使用重組 DNA 技術,編碼 GFP 的 DNA 可以標記在編碼其他蛋白質的 DNA 序列上,然後引入培養的活細胞或整個動物的特定細胞中。含有引入基因的細胞將產生帶有 GFP 標籤的蛋白質,該蛋白質在熒光顯微鏡下會發出綠色熒光。然後可以即時研究 GFP 標記蛋白在活細胞中的定位和運動。GFP 的多種變體已被工程化,它們在不同的波長下發射光。它們允許在同一個細胞中同時視覺化多種蛋白質。
與使用光學透鏡聚焦光束的光學顯微鏡不同,在電子顯微鏡中,電磁透鏡聚焦電子束。由於電子被空氣中的原子吸收,因此樣品必須安裝在真空管中的真空中。電子顯微鏡對生物材料的解析度最好為 0.10 奈米。在透射電子顯微鏡中,電子束被直接照射到樣品上,然後使用電子磁透鏡將透射電子聚焦以在觀察螢幕或照相底片上產生影像。與標準光學顯微鏡一樣,觀察樣品的薄切片。但是,對於透射電子顯微鏡,切片必須薄得多(50-100 奈米厚)。由於電子均勻地透過生物材料,未染色的樣品會產生非常差的影像。因此,必須常規地對樣品進行染色,以便散射一些入射電子,這些電子不會被電磁透鏡聚焦,因此不會形成影像。重金屬如金和鋨常用於染色生物材料。特別是四氧化鋨優先染色某些細胞組分,如膜,在影像中呈黑色。透射電子顯微鏡具有足夠高的解析度,可以用來獲得有關純化的蛋白質、病毒和亞細胞器形狀的資訊。抗體可以類似於在熒光顯微鏡中用熒光化合物標記的方式用電子緻密的金顆粒標記,然後與樣品薄切片中的特定靶蛋白結合。當在電子顯微鏡下觀察時,在抗體分子結合到其抗原的任何地方,影像中都可以看到由金顆粒形成的小黑點,因此該技術可以用來定位特定的抗原。
在掃描電子顯微鏡中,(未切片)樣品被固定,然後塗上一層薄薄的重金屬,如鉑。然後電子束掃描樣品,激發樣品內的分子,釋放二次電子。這些二次電子被聚焦到閃爍探測器上,得到的影像顯示在陰極射線管上。掃描電子顯微鏡產生三維影像,因為樣品上任何一點產生的二次電子的數量取決於電子束相對於樣品表面的角度。掃描電子顯微鏡的解析度為 10 奈米,比透射電子顯微鏡低 100 倍左右。
David Hanes,Nigel Hooper。生物化學。泰勒與弗朗西斯集團。紐約。2005 年。