細菌核糖體組裝的結構生物化學/生物物理學研究
核糖體作為一種核糖核蛋白複合物，其關鍵功能之一是蛋白質合成。在超速離心過程中，細菌核糖體沉澱為70S顆粒，該顆粒由30S小亞基和50S大亞基組成。小亞基由16S核糖體RNA和21個核糖體蛋白組成，而大亞基由兩個23S核糖體RNA和33個核糖體蛋白組成。小亞基主要負責在翻譯開始和解碼過程中與信使RNA結合，從而解析決定將哪個氨基酸插入多肽鏈的3-nt密碼子。另一方面，大亞基充當肽醯轉移酶中心，因此是肽鍵形成的位點。完整核糖體（包括30S亞基和50S亞基）的結構被解析，以確認核糖體實際上是一種核酶，並且催化位點確實位於核糖體RNA組分中。這些結構是確定翻譯機制的關鍵因素，但關於核糖體如何組裝成穩定的多組分複合體的資訊仍然非常有限。核糖體組裝是核糖體生成的中心，它涉及以下步驟
(1) 適當摺疊核糖體RNA和核糖體蛋白
(2) 組裝因子的結合和解離
(3) 核糖體蛋白的修飾和翻譯
(4) 核糖體蛋白的結合
(5) 核糖體RNA的加工、修飾和轉錄
大多數這些步驟與核糖體RNA的轉錄同時進行，核糖體組裝過程透過蛋白質結合事件和RNA構象變化進行。在這些事件中，核糖體蛋白的結合穩定了RNA摺疊過程，並最終推動RNA結構達到最終的天然狀態。總的來說，核糖體是一種重要的蛋白質結構，用於研究RNA的原理、RNA蛋白質識別、蛋白質摺疊和多組分複合體的組裝。組裝錯誤的核糖體可能會導致疾病，因此研究核糖體生物合成可能為開發更有效的治療疾病方法提供見解。對於科學家來說，瞭解完整核糖體的時間和物理途徑至關重要，因為只有這樣他們才能獲得有關細菌核糖體組裝過程中調控和可能發生的錯誤的知識。
細菌核糖體的結構由50多種蛋白質和三個大型結構域RNA分子組成。rRNA的修飾需要數十種基因產物，但這些修飾在核糖體功能中的作用尚不清楚，或者似乎並不重要。據信這些修飾是穩定RNA結構或RNA-蛋白質相互作用的一部分，介導翻譯，或作為核糖體組裝中的檢查點。某些生物物理方法的發展有助於更好地瞭解細菌核糖體的構建方式以及其結構如何導致功能。核糖體組裝不當會導致人體發生各種疾病，因為核糖體組裝在細胞中起著重要的作用，例如RNA蛋白質識別。因此，瞭解核糖體組裝是瞭解它們如何連線在一起的必要條件。研究核糖體如何調節有助於弄清楚組裝生物合成中錯誤是如何以及為什麼發生的。這三個貢獻來自質譜、計算方法和RNA摺疊研究。細菌核糖體的代謝有助於確保其他組分的正確和及時合成。由於核糖體是大型複雜的巨型分子，因此正確的產物非常重要，因此組裝過程需要高效的步驟。下表顯示了核糖體組裝過程中發生的事件順序，但不一定是嚴格的順序。所有這些事件都必須發生，但途徑可以是隨機的，並且在自然界中有所不同。
據認為，細菌核糖體的組裝透過一系列交替的RNA構象變化以及蛋白質結合事件進行。這些細菌核糖體的組裝在體內比在體外快得多，效率也更高。
| 1) 核糖體RNA的轉錄 - rRNA作為單個轉錄本被轉錄。 2) 核糖體蛋白的合成 - 大約55種核糖體蛋白在轉錄和轉錄後基因調控機制中合成。 3) 核糖體RNA修飾 - 核糖體蛋白在大約30-40個特定位置被修飾，方法是鹼基甲基化和/或假尿嘧啶化。組裝的作用是穩定RNA結構或RNA蛋白質相互作用。 4) 核糖體蛋白修飾。 5) 核糖體RNA加工 - 生成成熟的rRNA 6) 核糖體RNA共轉錄摺疊 7) 核糖體蛋白共轉錄結合 8) 組裝因子結合和釋放 - 在促進組裝的有序高效過程的不同時間結合。
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隨著可以輕鬆確定高解析度核糖體結構的技術不斷發展，過去幾十年進行的實驗研究在某種程度上被忽視了。這些研究沒有專注於核糖體的結構，而是專注於確定核糖體的組成部分。在20世紀50年代後期，研究人員得出結論，核糖體的各種亞基組分實際上是同一顆粒的不同物理狀態，這些狀態受鎂離子濃度的調節。Tissieres和Watson成功地證明，細菌核糖體由一個70S顆粒組成，該顆粒可以聚合形成100S顆粒，也可以分解成大亞基和小亞基。後來在20世紀60年代，Traub和Nomura取得了重大進展。他們證明，體外從遊離的核糖體RNA和核糖體蛋白組裝成活性30S亞基需要額外的組分。換句話說，核糖體RNA和核糖體蛋白擁有組裝核糖體所需的所有資訊。重組核糖體蛋白、體外轉錄的未修飾16S核糖體RNA以及與純化蛋白結合的16S核糖體RNA可以重構成30S顆粒。此外，30S顆粒包含三個結構域，包括平臺區域、頭部和主體；該亞基的每個結構域都可以獨立地重構成。此資訊非常重要，因為它提出了透過簡單地改變各種組分來觀察核糖體組裝過程的可能性。儘管早期研究中這種簡單的觀點對一些科學家來說似乎值得懷疑，但它為核糖體組裝和生物合成的持續研究奠定了堅實的基礎。
質譜與核糖體結合的三個主要應用是不同組分的清單、核糖體修飾的識別和核糖體動力學的分析。繪製修飾圖的能力使科學家能夠研究修飾在物種發育過程中的變化。這可以查明蛋白質修飾在組裝或翻譯中的具體作用。對分離的核糖體的分析是完全表徵新物種修飾的唯一方法。核糖體修飾導致特定的基因型，而研究基因型可以暗示這種核糖體蛋白修飾在組裝或翻譯中發揮什麼作用。iTRAQ質譜技術用於檢查組裝輔因子的突變。可以使用這種質譜法確定核糖體蛋白的分子量和序列。HDX應用揭示了結合的核糖體蛋白的哪個區域最靈活，因為這些區域在翻譯步驟中很重要。
核糖體中大量的原子使得這種方法極具挑戰性。透過這種方式，已經證明蛋白質結合位點的靈活性與蛋白質在該位點結合的階段直接相關。一級結構蛋白在更剛性的位點結合，而二級和三級結構在更靈活的位點結合。此外，計算方法表明，組裝的順序是由靜電結合引導的。這些能量直接反映了靈活性變化和靜電變化。
生化方法提供了對組裝過程中發生的一系列構象變化的深入理解。最快的摺疊區域據說是發生在主要的蛋白質結合位點，這個結合位點是產生成熟的核糖體蛋白亞基所必需的。5’ 結構域快速自摺疊的作用是在組裝過程中共轉錄合成。透過使用含有 15 種核糖體蛋白子集的重組中間體 (RI) 可以組裝並檢查核糖核蛋白的構象變化，在低溫下進行重組反應。RI 中間體的構象變化是透過加熱發生的。然後形成新的結構 (RI*)，該結構具有結合剩餘的五種蛋白質並形成 30S 亞基的能力。蛋白質結合反應的靈活性是由於 RNA 在不同溫度下對探針的可及性存在差異。此外，由於中間的 RNA 摺疊反應，蛋白質在不同時間結合到 rRNA 的不同區域。結合速率的溫度依賴性。這確實揭示了每個核糖體蛋白結合的獨特動力學障礙。
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