結構生物化學/色譜/薄層
薄層色譜 (TLC) 是一種在有機實驗室中非常有價值的技術。它用於分離混合物，檢查混合物的純度，或監測反應的進展。溶質的極性、溶劑的極性和吸附劑的極性是決定化合物在 TLC 板上遷移率的關鍵因素。該技術有助於根據不同混合物的遷移率差異來分離它們。TLC 也可以透過將其與已知化合物進行比較來識別化合物。
薄層色譜 (TLC)：該技術用於使用液體溶劑（流動相）和塗有矽膠（固定相）的玻璃板來分離乾燥的液體。基本上，我們可以在 TLC 中使用任何有機物質（纖維素聚醯胺、聚乙烯等）或無機物質（矽膠、氧化鋁等）。這些物質必須能夠分解並形成均勻的層。在板的表面上，將有一層非常薄的矽膠，被認為是固定相。然後，在寬口容器（例如燒杯或展開缸）中加入少量溶劑，足以覆蓋容器的底部。將製備好的 TLC 板放入密封的容器中，其中含有少量溶劑（移動相）。由於毛細作用，溶劑向上移動到板子上，現在我們可以取出板子並分析 Rf 值。
通常 TLC是在塗有矽膠、氧化鋁或纖維素的玻璃、塑膠或鋁板上進行的。這種塗層稱為固定相。然後將樣品塗抹到板的底部，並將板放入溶劑或流動相中。毛細作用將樣品推到板子上方。樣品在板上移動的速度取決於樣品與固定相結合的緊密程度。這是由極性決定的。然後比較 Rf 值或保留因子進行分析。溶質的阻滯因子定義為化合物移動距離與溶劑在給定時間內移動距離的比率。因此，Rf 值將從最小值 0.0 到最大值 1.0 不等。然而，對於給定的蛋白質化合物，這種阻滯因子會隨著所用吸附劑和/或溶劑的變化而有很大差異。此外，阻滯因子會隨著吸附劑中水分含量的變化而有很大變化。然後比較 Rf 值或保留因子進行分析。這個 Rf 值可以量化為
Rf =（化合物移動的距離）/（溶劑移動的距離）
在板的底部大約 7 毫米處用鉛筆畫一條線，並在該線上放置一滴染料混合物溶液。為了顯示液滴的原始位置，必須用鉛筆畫線。如果用墨水畫線，墨水中的染料會與染料混合物一起向上移動到 TLC 板上，結果將不準確。為了獲得更準確的結果，用染料混合物在 TLC 紙上點幾次，試圖積累材料而不擴大斑點。直徑為 1 毫米的斑點將提供良好的結果。在點 TLC 板時，確保不要將混合物點得彼此太近，因為當染料混合物向上移動到 TLC 板時，它會與其他斑點發生碰撞，而 Rf 值將難以計算。
當斑點變幹後，將 TLC 板放入燒杯中，溶劑液麵低於鉛筆線。蓋住燒杯以確保燒杯中的大氣層飽和有溶劑蒸汽。用浸泡在溶劑中的濾紙在燒杯內襯，因為這將有助於分離混合物。用溶劑蒸汽飽和燒杯中的大氣層可以阻止溶劑在向上移動時蒸發。
當溶劑慢慢地向上移動到板子上時，染料混合物的不同組分以不同的速率移動，混合物被分離成不同的彩色斑點。讓溶劑繼續上升，直到它大約距離板的頂部 1-1.5 釐米。這為這種特定的溶劑和固定相組合提供了染料組分的最大分離。
一旦誘導了這種特定溶劑和固定相溶劑的染料組分的最大分離，將 TLC 板從燒杯中取出並使其乾燥。在取出 TLC 板後立即，在溶劑開始蒸發之前，用鉛筆標記溶劑前沿。溶劑前沿是溶劑在 TLC 板上上升到的線。然後，讓溶劑從 TLC 板上蒸發。用圓圈/標記分離的化合物以指示它們在板上的位置。在某些情況下，向上移動到 TLC 板上的化合物用肉眼觀察時沒有明顯的出現。在這種情況下，可以將 TLC 板短暫地浸入包含某些試劑的顯色溶液中，這些試劑將與分離的化合物反應，在加熱後形成有色化合物。另一種視覺化 TLC 板上分離的無色有機化合物的方法是將它們置於碘化物 (I2) 蒸氣中以測試其對碘化物蒸氣的吸收。將這些帶有無色標記的 TLC 板放入透過在密閉罐中放置少量碘晶體而製備的碘蒸氣浴中。在將 TLC 板放入浴中大約 10 分鐘後，無色斑點逐漸變成深棕色。由於彩色斑點通常在短時間內消失，因此在將 TLC 板從碘浴中取出後立即用鉛筆將其勾勒出來。
除了碘浴顯色技術外，熒光指示劑也可以幫助確定分離的化合物移動的距離。在黑暗的房間/區域中，使用短波紫外燈照射板的吸附劑側。許多化合物會降低熒光的強度。使用這種紫外光顯色技術，分離的化合物在熒光 TLC 板上顯示為暗點。在 365 奈米光下，通常更容易看到變暗的斑點。在紫外光源下用鉛筆勾勒出這些暗點，以永久記錄分析化合物移動的位置。
紫外光下 TLC 板解釋的一些示例
1. TLC 提供有用的定性結果和解釋。例如，如果一個人想將未知混合物中的組分與標準化合物 A 和 B 進行比較，則可以進行 TLC，如果未知物在紫外光下的暗點與化合物 A 和 B 的暗點一致，則未知物包含 A 和 B。
2. 如果未知物只有一個暗點，並且不確定化合物 A 的斑點是否與未知物的斑點處於同一水平，則可以將兩種化合物在 TLC 板上共同點樣以快速檢查。共同點樣是指將化合物 A 點樣在 TLC 板的一個區域，並將未知物點樣在與化合物 A 的斑點相同的區域。如果共同點樣泳道在紫外光下只有一個暗點，則未知物的身份是 A。
示例 1 的共同點樣結果應該只包含 2 個斑點，其中一個斑點代表化合物 A + 未知物中的一個組分，另一個斑點代表未知物混合物中的另一個組分。額外的斑點可能表明未知物中的一個組分與標準不匹配。
3. 如何才能判斷 A+B 之間的反應實際上發生了，從而得到新的產物 C？可以使用 TLC 進行檢查。化合物 A 和 B 分別點樣在 TLC 板上。然後將 A+B（C）的混合物點樣在 TLC 板上，並且在每次時間段後都可以點樣新的樣品（C2、C3 等）。
C1 上的兩個斑點與 A 和 B 對齊，表明這僅僅是 A+B 的混合物，而不是新的產物。C2 和 C3 仍然有一個斑點與反應物 A 對齊，但 C4 有兩個斑點與任何反應物都不匹配，而 C5 只有一個暗點。有兩個可能的解釋
1) C2 到 C4 是 C5 中新產物的中間體。
2) 所需的產物實際上是 C4，並且它會降解，最終在板上只有一個組分。
- 實驗室中的技巧
1) 使用毛細管將溶液轉移到 TLC 板上。較小的原點斑點將產生較小的區域，並在紫外光下更好地分離暗點，這將使 Rf 的計算更容易和更準確。
2) 含有 TLC 板和溶劑的容器應始終放在平面上，以便獲得用於執行的“直線泳道”。
您可能已經知道， TLC 板由矽膠製成，矽膠是一種極性化合物，這就是非極性化合物在 TLC 板上往往具有更大分離的原因。
如示意圖所示，最初使用的溶劑由正己烷和乙酸己酯按 7:3 的比例混合。這意味著與 TLC 板反應的溶劑中大部分是非極性的。由於溶劑缺乏極性，樣品和 TLC 板之間競爭性較弱，因此樣品的極性部分會更容易與矽膠發生反應，導致分離效果較差。由於沒有東西阻止樣品與矽膠反應，它會立即反應並導致分離效果較差。想象一隻狗沿著小路行走，如果它每遇到一棵樹就停下來聞一聞，它與起點的距離會比它一直走而不被周圍環境分散注意力要短。對於這些樣品也是如此，如果它們在移動過程中不斷與矽膠發生反應，它們就不會移動太遠。
當比率改變，乙酸己酯（更極性）的比例增加時，突然之間就出現了競爭性反應。樣品想要與 TLC 板發生反應，但溶劑（由於它現在更極性）也想要反應，因此樣品與 TLC 板之間的反應會減少。顯然，溶劑正在嘗試與 TLC 板發生反應，導致樣品沒有太多機會“停下來聞一聞”，因此它被分離得更遠。樣品與 TLC 板的反應減少是因為現在溶劑也與相同的 TLC 板發生反應，這解釋了為什麼分離效果更好。
圖中的第三種 TLC 板有點棘手。有人可能會認為石油醚由於名稱（它含有醚）而具有半極性，但實際上石油醚是一種非極性化合物，由許多烴分子組成。這不會導致分離效果有任何差異。