結構生物化學/原核生物基因表達調控
原核生物在應對環境變化時最常用的方法是改變其基因表達。表達是指基因被轉錄成 RNA，然後翻譯成蛋白質。兩種型別的表達是組成型表達，其中基因不斷表達，以及調節型表達，其中細胞內需要滿足特定的條件才能表達基因。本小節重點介紹原核生物如何調節其基因的表達。
轉錄，即 DNA 轉換為 RNA，是控制基因活性的第一步。蛋白質與 DNA 序列相互作用以促進或阻止基因的轉錄。
請記住，就具有調控系統能夠識別的特徵而言，DNA 序列彼此無法區分。因此，在調節基因表達時，原核生物依賴其基因組中的其他序列，稱為調控位點。這些調控位點通常也是 DNA 結合蛋白結合位點，並且在原核生物中靠近用於轉錄的 DNA。
大腸桿菌中的一個調控位點示例：當將乳糖引入細菌的環境中時，編碼產生β-半乳糖苷酶的基因開始表達。這種酶的功能是加工乳糖，以便細胞可以從中提取能量和碳。
此調控位點（如圖所示）的核苷酸序列顯示幾乎完全反轉的重複。這表明 DNA 具有近乎兩倍的對稱軸，這通常與與該位點結合的蛋白質的對稱性相關。在研究蛋白質-DNA 相互作用時，通常存在對稱性。
進一步研究 lac 調控位點和發生在那裡的蛋白質-DNA 相互作用，科學家們觀察了識別 lac 位點的 DNA 結合單元與該位點本身（它是較大寡核苷酸的一部分）形成的複合物的結構。他們發現，lac 調控位點特異性的 DNA 結合單元來自 lac 阻遏蛋白。正如其名稱所暗示的那樣，lac 阻遏蛋白的功能是抑制乳糖加工基因的表達。這種 DNA 結合單元的二倍對稱軸與 DNA 的對稱性相匹配，並且該單元以二聚體的形式結合。來自蛋白質每個單體的 α 螺旋插入到 DNA 的主溝中。在這裡，氨基酸側鏈（透過高度位點特異性的氫鍵）與暴露的鹼基對相互作用，以至於 lac 阻遏蛋白只能非常緊密地結合到大腸桿菌基因組中的這個特定位點。
在確定許多原核生物 DNA 結合蛋白的結構後，在許多蛋白質中觀察到的一個結構模式是成對的 α 螺旋，由一個緊密的轉角隔開。這些被稱為螺旋-轉角-螺旋基序，由兩個不同的螺旋組成：第二個 α 螺旋（稱為識別螺旋）位於主溝中，並與鹼基對相互作用，而第一個 α 螺旋主要與 DNA 骨架接觸。
回顧之前關於大腸桿菌和β-半乳糖苷酶的例子，我們可以瞭解 DNA 結合蛋白如何進行調控的共同原則。當大腸桿菌的環境中缺乏葡萄糖（它們的主要碳和能量來源）時，細菌可以透過β-半乳糖苷酶將碳源切換為乳糖。β-半乳糖苷酶將乳糖水解成葡萄糖和半乳糖，然後被細胞代謝。滲透酶促進乳糖穿過細菌細胞膜的運輸，是必不可少的。另一方面，轉乙醯酶不是乳糖代謝所必需的，但它在解毒滲透酶也可能運輸的化合物方面發揮作用。這裡我們可以說，一組共同有助於適應細胞環境變化的酶的表達水平會一起變化。
在大腸桿菌中，在有葡萄糖或甘油等碳源的環境中生長的大腸桿菌，其體內大約有 10 個或更少的β-半乳糖苷酶分子。然而，當細菌在乳糖上生長時，這個數字會猛增到幾千個。僅乳糖的存在就會透過促進新酶的合成而不是啟用前體來大幅增加β-半乳糖苷酶的數量。
在弄清楚這種特定情況下基因調控的機制時，觀察到另外兩種蛋白質半乳糖苷滲透酶和硫代半乳糖苷轉乙醯酶與β-半乳糖苷酶一起合成。
β-半乳糖苷酶、轉乙醯酶和滲透酶協同調節的事實表明，一種共同的機制控制了編碼所有三種的基因的表達。弗朗索瓦·雅各布和雅克·莫諾提出了一個名為操縱子模型的模型來解釋這種平行調節和其他觀察結果。操縱子模型的三個遺傳部分是（1）一組結構基因，（2）一個操縱子位點（一個調控 DNA 序列），以及（3）一個編碼調控蛋白的調控基因。
為了抑制結構基因的轉錄，調控基因編碼一種用於與操縱子位點結合的阻遏蛋白。在乳糖操縱子的情況下，阻遏蛋白由 i 基因編碼，i 基因與 o 操縱子位點結合以阻止 z、y 和 a 基因（編碼 β-半乳糖苷酶的三種結構基因）的轉錄。操縱子上還有一個啟動子位點 p，其功能是將 RNA 聚合酶引導到正確的轉錄起始位點。當轉錄時，所有三個結構基因都會產生一個編碼β-半乳糖苷酶、滲透酶和轉乙醯酶的單一 mRNA。因為這種 mRNA 編碼多個蛋白質，所以它被稱為多順反子（或多基因）轉錄本。
在沒有乳糖的情況下，lac 阻遏蛋白與操縱子結合並阻止轉錄
lac 阻遏蛋白（如圖所示與 DNA 結合）是一種四聚體，具有氨基末端和羧基末端結構域。氨基末端結構域是與 DNA 結合的結構域，而羧基末端結構域形成一個獨立的結構。如圖所示的兩個亞基合併形成 DNA 結合單元。當細菌環境中沒有乳糖時，lac 阻遏蛋白緊密且迅速地與操縱子 DNA 結合（與基因組中的隨機位點相比，與操縱子的結合力強 4x10^6 倍）。阻遏蛋白的結合阻止 RNA 聚合酶轉錄啟動子位點下游的 z、y 和 a 基因，這些基因編碼三種酶。lac 阻遏蛋白與操縱子形成的複合物的解離常數約為 0.1 pM，締合速率常數高達 10^10 M-1s-1。這表明阻遏蛋白透過沿著 DNA 分子擴散來尋找操縱子，而不是透過與水介質的相遇。
就 lac 阻遏蛋白的 DNA 結合偏好而言，其特異性水平非常高，以至於它在大腸桿菌基因組中可以被稱為幾乎唯一的位點。當氨基末端結構域的二聚體與操縱子位點結合時，羧基末端結構域的二聚體能夠附著在距主要操縱子位點 500 bp 內的兩個位點之一，這兩個位點近似於操縱子的序列。每個單體透過螺旋-轉角-螺旋單元與結合的 DNA 的主溝相互作用。
現在我們來看看乳糖的存在如何改變阻遏物的行為以及操縱子的表達。所有操縱子都有誘導物——促進操縱子內基因表達的觸發因素——而乳糖操縱子的誘導物是異乳糖，它是由半乳糖和葡萄糖以α-1,6鍵連線形成的分子。
在β-半乳糖苷酶反應中，異乳糖是一種副產物，當細菌中β-半乳糖苷酶的含量很低時，它以低水平產生。此外，雖然不是酶的底物，但異丙基硫代半乳糖苷 (IPTG) 是一種強大的 β-半乳糖苷酶表達誘導劑。
在乳糖操縱子中，誘導物促進基因表達的方式是抑制乳糖阻遏物與操縱子結合。它透過與乳糖阻遏物本身結合來抑制，從而極大地降低了阻遏物與操縱子 DNA 結合的親和力。誘導物在每個單體的大結構域中心結合，導致阻遏物 DNA 結合域的構象變化。這些變化極大地降低了阻遏物的 DNA 結合親和力。
原核生物中許多其他基因調控複合體功能類似於乳糖操縱子。另一個類似網路的例子是參與嘌呤（以及在一定程度上嘧啶）合成的網路。這些基因受到嘌呤阻遏物的抑制，嘌呤阻遏物與乳糖阻遏物的序列一致性為 31%，具有相似的 3D 結構。然而，在這種情況下，嘌呤阻遏物的行為與乳糖阻遏物相反：它只有在與一個小分子稱為輔阻遏物（鳥嘌呤或次黃嘌呤）結合時，才會透過與特定 DNA 位點結合來阻止轉錄。
雖然之前提到的 DNA 結合蛋白都是透過阻止 DNA 序列的轉錄直到環境中滿足某些條件才發揮作用，但也有 DNA 結合蛋白的例子實際上促進轉錄。
大腸桿菌中的分解代謝啟用蛋白就是一個很好的例子。當細菌在葡萄糖中生長時，它含有很少量的分解代謝酶，這些酶的功能是代謝其他糖。編碼這些酶的基因實際上受到葡萄糖的抑制，這種效應被稱為分解代謝阻遏。葡萄糖降低 cAMP（環狀 AMP）的濃度。當 cAMP 的濃度高時，它會刺激用於分解其他糖的這些分解代謝酶的轉錄。這就是分解代謝啟用蛋白（CAP 或 CRP，cAMP 受體蛋白）發揮作用的地方。CAP 與 cAMP 結合後，會刺激阿拉伯糖和乳糖分解代謝基因的轉錄。CAP 僅與特定 DNA 序列結合，作為二聚體結合到相對於轉錄起始位點 -61 位置的倒位重複序列上，與 RNA 聚合酶結合的位置相鄰（如圖所示）。
這種 CAP-cAMP 複合物透過使 RNA 聚合酶和 CAP 之間的接觸在能量上變得有利，將轉錄提高了約 50 倍。在大腸桿菌基因組中有多個 CAP 結合位點，因此增加細菌環境中 cAMP 的濃度將導致這些 CAP-cAMP 複合物的形成，從而導致編碼各種分解代謝酶的許多基因的轉錄。
在研究基因調控網路及其功能時，對細菌病毒的研究——尤其是 λ噬菌體——非常有價值。λ噬菌體能夠透過溶菌途徑或溶原途徑發展。在溶菌途徑中，病毒基因組中的大多數基因進行轉錄，導致大量病毒顆粒的產生（約 100 個）以及細菌的最終裂解。在溶原途徑中，細菌 DNA 將病毒基因組整合到自身中，大多數病毒基因保持不表達；這使得病毒遺傳物質能夠在細菌的複製中攜帶。病毒基因組中存在兩種必需蛋白和一組調控序列，它們是兩種途徑選擇之間轉換的原因。
λ 阻遏物是這些關鍵調控蛋白之一，當阻遏物的含量低時，它會促進編碼阻遏物的基因的轉錄。當阻遏物的含量高時，它會阻止基因的轉錄。它也是一個自調控蛋白。雖然 λ 阻遏物與 λ 噬菌體基因組中的許多位點結合，但這裡相關的位點是右側操縱子，該操縱子包括 3 個 λ 阻遏物二聚體的結合位點，以及大約 80 個鹼基對區域內的 2 個啟動子。第一個啟動子的作用是驅動 λ 阻遏物基因的表達，而另一個啟動子負責驅動各種其他病毒基因的表達。λ 阻遏物與第一個操縱位點結合的親和力最高；當它與第一個操縱位點結合時，蛋白與相鄰操縱位點結合的可能性會增加 25 倍。當第一個和第二個操縱位點結合了這些複合物時，λ 阻遏物二聚體抑制了編碼 Cro 蛋白（阻遏物和其他蛋白的控制者）的相鄰基因的轉錄。第二個操縱位點的阻遏物二聚體可以與 RNA 聚合酶相互作用，從而刺激控制編碼 λ 阻遏物的基因的轉錄的啟動子的轉錄。這就是 λ 阻遏物促進自身產生的方式。λ 阻遏物融合可以用來研究大腸桿菌中的蛋白-蛋白相互作用。λ 阻遏物中有兩個不同的結構域：N 末端（DNA 結合活性）和 C 末端結構域（二聚化）。為了獲得活性阻遏物融合，應將 C 末端結構域替換為異源二聚體結構域，並形成二聚體或更高階的寡聚體。然而，非活性阻遏物融合不能與 DNA 序列結合，從而影響噬菌體或報告基因的表達。[1]
我們可以在上圖中看到 λ 阻遏物如何透過與第一個操縱位點結合（具有最高的親和力）來阻止 Cro 的產生。同時，Cro 透過與第三個操縱位點結合（具有最高的親和力）來阻止 λ 阻遏物的產生。整個迴路是決定溶菌途徑還是溶原途徑的決定性因素：如果 λ 阻遏物高，而 Cro 低，則選擇溶原途徑；如果 Cro 高，而 λ 阻遏物低，則選擇溶菌途徑。
一些原核生物也已知會經歷一個過程，在這個過程中它們會釋放稱為自誘導物的化學物質到它們的培養基中（群體感應）。這些自誘導物，通常是醯基高絲氨酸內酯，會被周圍的細胞吸收。當這些自誘導物的水平達到一定程度時，受體蛋白會與它們結合並激活幾個基因的表達，包括那些促進合成更多自誘導物的基因。這是一種原核生物之間進行化學相互作用以改變其基因表達模式的方式，具體取決於其培養基中周圍細胞的數量。進行這些群體感應機制的原核生物群落被稱為生物膜。
雖然大多數基因表達調控發生在轉錄起始階段，但轉錄的其他步驟也是調控的可能目標。
涉及結構基因突變的突變體是色氨酸營養缺陷型，需要色氨酸才能生長。為了將前體分子莽草酸轉化為色氨酸，trpE、trpD、trpC、trpB和trpA基因編碼一個多順反子資訊，而mRNA將被翻譯成執行轉化的酶。
第二種型別的突變體能夠組成性地合成色氨酸合成所需的酶。trpR基因編碼色氨酸阻遏蛋白。該基因與trp操縱子相比，位於大腸桿菌染色體上的另一個象限。trpR基因無法有效地調節色氨酸的合成。對二聚體trp阻遏蛋白的研究表明，它不能單獨發揮作用。阻遏蛋白必須與該代謝途徑的最終產物結合，才能調節色氨酸的合成。因此，色氨酸是自身生物合成的協阻遏物。這個過程被稱為轉錄水平的反饋抑制。
當色氨酸濃度足夠高時，阻遏蛋白與色氨酸結合形成阻遏蛋白-色氨酸複合物。該複合物將附著在trp操縱子的操縱子區域，阻止RNA聚合酶結合並啟動結構基因的轉錄。此外，當細胞中色氨酸濃度低時，由於缺乏色氨酸-複合物，RNA聚合酶能夠與基因結合並轉錄結構基因。因此，色氨酸將被生物合成。[2]
衰減是原核生物透過調節新生RNA二級結構來調節轉錄的一種機制。
[edit | edit source]在研究色氨酸操縱子的過程中，查爾斯·雅諾夫斯基發現了另一種轉錄調控方式。trp操縱子編碼5種將莽草酸轉化為色氨酸的酶，在檢查trp mRNA的5'端時，他發現第一個酶的起始密碼子之前有一個包含162個核苷酸的引導序列。他的下一個觀察是，當色氨酸水平高時，只有前130個核苷酸被生產成轉錄本，但當色氨酸水平低時，會產生包含整個引導序列的7000個核苷酸trp mRNA。這種調控方式被稱為衰減，其中轉錄在產生任何編碼酶的mRNA之前就被切斷了。
衰減取決於mRNA的5'端特徵。序列的第一部分編碼一個包含14個氨基酸的引導肽。衰減器位於該肽的開放閱讀框之後 - 它是一個能夠形成一些替代結構的RNA區域。因為細菌的轉錄和翻譯是緊密耦合的，所以說trp mRNA的翻譯在合成核糖體結合位點後不久就開始。
mRNA的結構因核糖體而改變，而核糖體因缺乏引導mRNA翻譯所需的氨醯基-tRNA而停滯。這使RNA聚合酶能夠在衰減器位點之後轉錄操縱子。
參考文獻
[edit | edit source]- ↑ Leonardo Mariño-Ramírez, Lisa Campbell, and James C. Hu. Screening Peptide/Protein Libraries Fused to the λ Repressor DNA-Binding Domain in E. coli Cells. 2003; 205: 235–250.
- ↑ Arkady B. Khodursky, Brian J. Peter, Nicholas R. Cozzarelli, David Botstein. DNA microarray analysis of gene expression in response to physiological and genetic changes that affect tryptophan metabolism in Escherichia coli. 2000 October 24; 97(22): 12170–12175. Published online 2000 October 10.