結構生物化學/使用熒光顯微鏡計數蛋白質
兩種計數蛋白質分子的方法被廣泛使用：逐步光漂白和與熒光標準的比率比較。
熒光發生在光被吸收後從熒光團發出光，而GFP能夠在沒有酶促修飾或輔因子的情況下發出熒光，這允許單個基因在任何生物體中表達可檢測到的發射。 計數活細胞中蛋白質分子的數量使研究人員能夠確定功能性蛋白質複合物的化學計量，並尋求細胞結構模型。 由於全基因組研究可能無法識別有關低丰度蛋白質或區域性蛋白質濃度的資訊，因此單分子技術如果成功，將能夠解決這個問題。
逐步光漂白是熒光顯微鏡計數蛋白質分子的方法之一，它“依賴於熒光蛋白 (FP) 反覆暴露於光源導致的不可逆和隨機熒光損失。” 樣品將持續暴露於低強度的激發光，以使樣品“緩慢漂白，直到其發射強度達到背景水平。” 結構中存在的熒光分子數量決定了合適的激發光強度和曝光時間。 由於會顯示出大約是其他步驟兩倍大小的步驟，因此需要儘量減少漏漂白事件。 漂白方法僅適用於低蛋白質數量，因為漏漂白事件的機率隨著結構中分子數量的增加呈指數增長。 “Das 等人估計，在沒有數學外推的情況下，最多可以檢測到 15 個漂白步驟，儘管他們在實驗中只檢測到 7 個步驟。” 使用數學輔助工具，透過光漂白可以計數的分子最大數量可以增加到大約 30 個分子。 需要進行背景校正以消除來自擴散蛋白的熒光並校準初始強度。 在光漂白過程中，應選擇感興趣區域 (ROI) 以避免混淆多個結構。 由於原始資料存在噪聲，因此還必須過濾資料以揭示離散下降。 例如，Chung-Kennedy 濾波器是用於定量細菌複製體的最常用的濾波器。 “它計算一個光漂白 ROI 資料中兩個連續集中資料的均值和標準差，並報告標準差較低的集的均值。” 資料集中的平均資料點數應該足夠大以減少噪聲，但又足夠小以確保不會漏掉幾個步驟。
此方法涉及測量蛋白質樣品與標準品的熒光強度的比率。 它使用一系列表達蛋白質樣品或標準品的細胞影像，這些細胞透過與 FP 融合獲得了熒光特性。 “如果標準品可以與感興趣的蛋白質區分開來，則最好在同一張載玻片上包含表達標準品和實驗融合蛋白的細胞，以確保照明的可比性。 如果標準品不可區分，則可以連續拍攝影像，或者可以使用另一個標記物單獨成像以區分遠處對照細胞，從而消除福斯特共振能量轉移。” 此方法的優點是能夠計數相對較多的蛋白質分子。 需要進行校正以獲得更準確的測量結果。 例如，如果使用整個視野，則需要校正顯微鏡系統中不均勻的照明。 此外，如果樣品分子相對於蓋玻片的深度不同，則應使用熒光珠對深度對強度影響進行校準。 可以使用不同的曝光時間來控制信噪比並避免飽和。 激發強度應保持恆定，以避免由於閃爍分子導致的光子計數發生非線性變化。 “除非存在重疊的相鄰訊號或不均勻的細胞質強度，否則應從同心區域獲取背景。” 使用可靠的標準對於這種方法非常重要。 當比較不同大小的蛋白質或結構相同但強度差異很大的蛋白質時，應使用多個 z 截面的強度總和。 應使用基因組 DNA 測序等方法進行額外的驗證，以確保所測量的數字的準確性。 使用比率方法可以獲得每個蛋白質的分子數量及其相對化學計量，這可以在一個或多個時間點獲得。
應使用基因編碼的 FP，以產生與蛋白質樣品 1:1 的化學計量，這可能會影響成熟效率或未摺疊 FP 的比例。
研究人員應使用最佳可用的 FP，以最大限度地提高信噪比，特別是對於丰度較低的蛋白質。 在構建融合蛋白之前，應考慮用於融合的 FP 的摺疊和成熟效率、亮度和光穩定性。 在出芽酵母釀酒酵母和 E. 大腸桿菌中摺疊的 YFP 中進行的研究表明，YFP 成熟和摺疊效率對於計數蛋白質不是主要問題，特別是對於週轉率低的蛋白質。
使用酵母是有利的，因為熒光融合蛋白可以使用同源重組替換天然蛋白，這使得能夠確定融合蛋白的功能。 透過在 FP 和蛋白質樣品之間使用靈活的連線體，可以改善某些蛋白質的功能。 由於內源基因不能用標記版本替換，因此需要使用其他蛋白質計數方法。 可以透過在免疫印跡後進行校正來量化肌動蛋白斑點中的區域性肌動蛋白丰度。 但是，這種方法只有在假設標記和未標記的肌動蛋白以相似的效率用於肌動蛋白斑點的情況下才有可能。 Engel 等人在突變背景下使用逐步光漂白方法來計數綠藻萊茵衣藻鞭毛中外源標記蛋白中的外源標記蛋白。 由於內源基因不會定位，因此標記和未標記蛋白的比率假設不需要成立。 最近開發的“基因組編輯”技術使得能夠在任何模型生物體中標記內源基因，其中“鋅指核酸酶或轉錄啟用因子樣效應物核酸酶基因可以被引入。”
測量蛋白質數量的環境非常重要。早期研究採用體外標準，其中背景對熒光強度的影響未知。這意味著需要免疫印跡或內標來校準細胞內的熒光強度。最近的實驗表明，體外 YFP/GFP 與細菌或酵母中的 YFP/GFP 相當。此外，如果 FP 被緊密地包裝成結構，則會發生熒光淬滅。淬滅對計數蛋白質的影響應根據目標結構的具體情況進行單獨檢查。藉助專用裝置和分析的熒光壽命成像可用於測量由環境變化引起的淬滅。
細胞濃度應透過稱為流式細胞術或熒光相關光譜的細胞分選裝置進行驗證，以獲得更高的解析度。同樣重要的是要確保來自熒光顯微鏡的蛋白質濃度與定量免疫印跡一致。在任何蛋白質計數實驗中，合適的熒光蛋白基因、合適的標準和環境變化或淬滅可能性控制將確保對資料的適當解釋，然後可以透過補充實驗進行確認。
超解析度顯微鏡技術可以產生細胞內結構的高解析度影像，從而精確地定位單個熒光分子。對於此類技術，最重要的是簡化 FP 高密度影像的分析，並將由於閃爍或光漂白失敗造成的錯誤降至最低。單分子技術現在更常用於觀察平均群體行為中的隨機事件。使用此類技術的好處是可以直接計數分子，無需使用集體影像，甚至可以確定位於衍射極限區域內的不同蛋白質複合物。超解析度成像可以導致對更多蛋白質的量化。
計數細胞中的蛋白質分子對於確定結構模型和蛋白質功能至關重要。在體外，蛋白質數量有助於確定反應速率，並更多地瞭解多蛋白質。介紹的兩種方法是逐步光漂白和與給定標準的比率比較。這可以在任何配備熒光顯微鏡的實驗室中使用來分離特定蛋白質。當然，每種方法，包括這種方法，都有很多優點和缺點。FP 的特性對兩種方法都非常重要。還有其他方法可以幫助驗證蛋白質的數量，例如電子顯微鏡。熒光顯微鏡有助於確定蛋白質的精確數量及其結合範圍。
來源: Coffman VC, Wu JQ. Trends Biochem Sci. 2012 年 9 月 1 日。