結構生物化學/DNA 擴增技術：聚合酶鏈式反應 (PCR)

歷史

1984 年，Kary Mullis 發明了一種擴增 DNA 序列的方法。在以前的嘗試中，DNA 聚合酶無法承受溫度變化。然而，Mullis 在他的方法中使用了來自嗜熱菌 (Thermus aquaticus) 的聚合酶，這種細菌生活在溫泉中，這使得 PCR 可以在高溫條件下進行。

概述

聚合酶鏈式反應 (PCR) 是一種非常有效的技術，可以獲得特定 DNA 鏈的多個相同副本（擴增 DNA）。PCR 可用於擴增 DNA、突變 DNA、刪除 DNA 和引入限制性內切酶位點。PCR 透過重複一個迴圈來進行，該迴圈由幾個步驟組成。此過程在指定目標 DNA 區域或要擴增的 DNA 序列（目標序列）後執行。目標序列顧名思義，是特定部分的 DNA，需要進一步研究。簡而言之，一個 PCR 迴圈包括以下步驟：

PCR 迴圈重複之前的準備
- 將 PCR 成分新增到含有待擴增 DNA 的溶液中
  - 此步驟僅在第一個 PCR 迴圈之前執行。建議在第一個迴圈之後不要新增成分，因為 PCR 反應對溫度敏感（溫度的微小變化會極大地影響反應）
  - 要新增的成分如下：
    - DNA 模板，在此過程中要進行擴增。
    - 一對引物（通常在 10-30 個核苷酸之間），與側翼序列（目標序列直接左側或右側的幾個鹼基）互補。這兩個不同的引物將被稱為引物 F（正向引物）和引物 R（反向引物）。
    - 四個dNTP（脫氧核糖核苷酸三磷酸）；它們是：dATP、dGTP、dCTP 和 TTP
    - 氯化鎂 (MgCl₂)，以穩定磷酸基團的電荷並激活複製過程。
    - 耐熱 DNA 聚合酶；耐熱性非常重要，因為 PCR 反應在不同的溫度下進行。這種耐熱 DNA 聚合酶是從一種嗜熱細菌嗜熱菌 (Thermus aquaticus)中獲得的，這種細菌生活在溫泉中。因此，這種 DNA 聚合酶被稱為Taq DNA 聚合酶。根據 PCR 的目的和要求，可以使用具有不同特性的其他聚合酶；例如，某些聚合酶，如 Pfu Turbo，具有更高的保真度，但對它們的要求高得多。
    - 緩衝溶液以穩定 DNA 樣本。
    - 為了最大限度地提高此過程的效率，可以使用混合液，其中包含引物、MgCl₂、緩衝液和 Taq 聚合酶。
  - 這些成分必須過量新增，以確保當兩條 DNA 鏈在第二步中分離時，兩條 DNA 重新雜交的可能性最小化。

PCR 迴圈（執行大約 20-30 個迴圈）
1. 鏈分離
  - 鏈分離是為了將目標序列和側翼序列暴露給引物。此步驟是透過加熱溶液來完成的，導致維持雙螺旋結構的氫鍵斷裂。
  - 引數
    - 溫度：約 95^oC
    - 時間：15 到 30 秒（將 DNA 分離成 2 條單鏈）
2. 引物雜交（也稱為退火步驟）
  - 在此步驟中，溶液冷卻至約 54^oC。透過冷卻溶液，允許引物透過氫鍵與側翼序列雜交。
  - 兩條主鏈重新雜交的可能性非常大，因為兩條鏈彼此互補。幸運的是，如前所述，可以透過在溶液中加入過量的引物來輕鬆避免這種情況。預期過量的引物會在任何兩條互補的 DNA 雜交之前與側翼序列雜交。
3. DNA 合成（也稱為延伸步驟）
  - 溶液加熱至 72^oC。在這種最佳溫度下，Taq 聚合酶將開始延伸兩個引物。
  - 有兩種引物；每種都是側翼序列的互補寡核苷酸。
  - 延伸的過程與 DNA 的常規聚合類似。引物從 5' 端到 3' 端延伸（這與實際 DNA 鏈的方向相反；包含目標序列、側翼序列和未擴增序列的鏈）。

- 注意:
  - 在第一個迴圈結束時，除了原始 DNA 鏈之外，我們還獲得了兩種新型鏈。這些鏈是每種引物的延伸。它們包含：
    - 一個引物（例如：引物 A）
    - 目標序列
    - 側翼序列的互補序列（未與該鏈中包含的引物雜交的序列；例如：引物 B 側翼序列的互補序列）
    - 此側翼序列互補序列之後其餘的非目標序列。
  - 在第二個迴圈中，一些引物將與第一個迴圈中獲得的新型序列雜交（例如：在從引物 A 延伸的較短鏈上，引物 B 將附著到其側翼序列並開始延伸迴圈，直到它到達較短鏈的末端，即引物 A 的側翼序列）。
  - 在第二個迴圈中，形成的新型鏈，短鏈包含：
    - 一個引物（例如：引物 B）
    - 目標序列
    - 可以與引物 A 雜交的側翼序列
  - 在第二個迴圈中，除了形成短鏈之外，還可以形成與第一個迴圈中形成的相同的鏈。
  - 從第二個到第 n 個迴圈，短鏈以指數級擴增，而稍長的鏈（第一個迴圈中形成的唯一鏈）以算術級擴增。
  - 此迴圈重複n次。在第n次重複時，將有 2ⁿ 個所需序列。

檔案：PCR 步驟.jpg

具有詳細步驟的 PCR 過程。可以重複多次迴圈以擴增原始 DNA 結構

最後，反應通常在完成後的 4 攝氏度下保持，以穩定對溫度敏感的 DNA。

額外步驟

在最後一個 PCR 迴圈完成後，在 70-74°C 下進行最後一步延伸，持續至少 5 分鐘。此步驟將保證任何剩餘的 DNA 鏈完全延伸。此外，可以在 4°C 下無限期地進行保持步驟，以儲存 DNA 產物。

熱迴圈儀

檔案：新型 PCR 機器.jpg

具有溫度梯度的 PCR 機器

熱迴圈儀可以透過不斷冷卻和加熱試管來執行 PCR 過程的不同步驟。它們使用珀耳帖效應，該效應允許透過簡單地反轉電流來加熱和冷卻固定 PCR 管的塊。薄壁反應管，無 RNAase 和 DNAase，適合 PCR。由於它們的厚度，它們可以創造熱導率，以實現快速熱平衡。如下一張圖片所示，大多數現代熱迴圈儀將具有加熱的蓋子，以防止反應管頂部的冷凝和每個管底部的蒸發。

結果解釋

為了確保 PCR 擴增的質量，需要進行凝膠電泳。為了準備這一步，需要在事先完成一系列步驟：

1. 準備 1% 瓊脂糖凝膠：稱取 1 克純化的瓊脂糖，用 TAE（Tris-乙酸）緩衝液溶解至 100 毫升。（圖 A）

2. 加熱。將溶液在微波爐中加熱，直到所有瓊脂糖顆粒完全溶解。

3. 新增溴化乙錠。溶液冷卻後，向溶液中加入 5 微升溴化乙錠。溴化乙錠將附著到 DNA 分子上，並在紫外光背景下使鏈脫穎而出（用作核酸染色劑）。

4. 瓊脂糖聚合。在插入一個孔板以將樣品載入到其中之後，等待瓊脂糖完全聚合。此過程可能需要長達 30 分鐘。

**圖 B**：瓊脂糖聚合。此過程可能需要長達 30 分鐘。在此過程中，托盤不可移動

5. 新增緩衝溶液。用 TAE 溶液充滿腔室，以在外部環境和 DNA 樣本之間形成屏障。

6. 新增 DNA 樣本。應將上樣緩衝液新增到 DNA 樣本中，並執行適當的 DNA 梯度，以確定樣本中千鹼基對的大致分子量。

7. 施加電流。DNA 必須位於靠近負極的位置，遠離正極。

8. 使用紫外光視覺化結果。

檔案：UV 視覺化.jpg

圖 F：凝膠的紫外視覺化

優點

PCR 是一種流行的 DNA 擴增方法，因為它具有多種優勢。其中一些優勢包括：

研究人員不需要闡明目標序列的序列。他們只需要知道側翼序列的序列。
即使目標序列遠大於引物，仍然可以合成。
製備的引物不必與側翼序列完全匹配。
PCR 非常特異性。
PCR 非常敏感，能夠擴增單個 DNA 分子。
得到的 DNA 可以進一步處理，例如突變、缺失或克隆過程。

機制

在這個例子中，使用以下約定：

BOLD = 側翼序列及其互補序列
ITALICS = 目標序列及其互補序列
NORMAL = 剩餘序列（DNA 鏈未擴增的部分）
BOLD/ITALICS= 引物

PCR 不同階段形成的序列

原始 DNA 分子

...CGCG TTG CAGCTACTGACTC CCC CGCG...
...GCGC AAC GTCGATGACTGAG GGG GCGC...

分離和連線引物後（第一個迴圈開始）

...CGCG TTG CAGCTACTGACTC CCC CGCG...

AAC

CCC

...GCGC AAC GTCGATGACTGAG GGG GCGC...

第一次序列延伸後（第一個迴圈結束）

...CGCG TTG CAGCTACTGACTC CCC CGCG...

AAC GTCGATGACTGAG GGG GCGC...

...CGCG TTG CAGCTACTGACTC CCC
...GCGC AAC GTCGATGACTGAG GGG GCGC...

分離序列並連線另一個引物後（第二個迴圈開始；與第一個迴圈中形成的序列相同的序列形成未顯示）

...CGCG TTG CAGCTACTGACTC CCC CGCG...

AAC GTCGATGACTGAG GGG GCGC...

CCC

AAC

...CGCG TTG CAGCTACTGACTC CCC

...GCGC AAC GTCGATGACTGAG CGG GCGC...

序列延伸後（形成短序列，第二個迴圈結束）

...CGCG TTG CAGCTACTGACTC CCC CGCG...

AAC GTCGATGACTGAG GGG GCGC...

TTG CAGCTACTGACTC CCC

AAC GTCGATGACTGAG GGG

...CGCG TTG CAGCTACTGACTC CCC

...GCGC AAC GTCGATGACTGAG CGG GCGC...

分離短序列並新增引物後（第三個及後續迴圈開始；僅顯示短序列形成）

...CGCG TTG CAGCTACTGACTC CCC CGCG...

AAC GTCGATGACTGAG GGG GCGC...

TTG CAGCTACTGACTC CCC

AAC

CCC

AAC GTCGATGACTGAG GGG

...CGCG TTG CAGCTACTGACTC CCC

...GCGC AAC GTCGATGACTGAG CGG GCGC...

延伸短序列後（第三個及後續迴圈結束；僅顯示短序列形成）

...CGCG TTG CAGCTACTGACTC CCC CGCG...

AAC GTCGATGACTGAG GGG GCGC...

TTG CAGCTACTGACTC CCC

AAC GTCGATGACTGAG GGG

TTG CAGCTACTGACTC CCC

AAC GTCGATGACTGAG GGG

...CGCG TTG CAGCTACTGACTC CCC

...GCGC AAC GTCGATGACTGAG CGG GCGC...

短序列將重新分離，以便新的引物可以在後續迴圈中連線。

TTG CAGCTACTGACTC CCC

AAC

CCC

AAC GTCGATGACTGAG GGG

TTG CAGCTACTGACTC CCC

AAC

CCC

AAC GTCGATGACTGAG GGG

引物將延伸形成額外的短序列。最後兩點在後續迴圈中重複，直到合成足夠的靶序列。

TTG CAGCTACTGACTC CCC

AAC GTCGATGACTGAG GGG

TTG CAGCTACTGACTC CCC

AAC GTCGATGACTGAG GGG

TTG CAGCTACTGACTC CCC

AAC GTCGATGACTGAG GGG

TTG CAGCTACTGACTC CCC

AAC GTCGATGACTGAG GGG

另一個 PCR 圖表

媒體：PCR diagrams.pdf

PCR 的實際應用

聚合酶鏈反應已成為醫學診斷的重要工具。PCR 可以檢測和識別導致感染的細菌和病毒，如結核病、衣原體、病毒性腦膜炎、病毒性肝炎、HIV 等。一旦為特定生物體的 DNA 設計了引物，使用 PCR 檢測患者血液或組織中病原體的存在或不存在就變得簡單了。由於 PCR 可以輕鬆區分我們每個人擁有的微小 DNA 變異（使我們每個人在基因上獨一無二），這種方法也導致了新型基因檢測的出現。這些檢測不僅診斷患有遺傳疾病的人，還診斷攜帶可能遺傳給後代的有害變異（突變）的人。這些攜帶者通常不受突變基因的影響，但他們可能會導致下一代出現疾病（例如，導致囊性纖維化的突變）。許多新型基因檢測是人類基因組計劃的結果，該計劃是確定和研究所有人類基因的巨大國際努力。該專案正在快速朝著最終目標發展，即對典型人類細胞中的整個 DNA 進行測序。DNA 測序意味著確定構成任何 DNA 鏈的四種不同核苷酸的精確順序。DNA 測序揭示了構成基因的核苷酸的關鍵變異。這些突變變化會導致疾病甚至死亡，迫使基因產生異常蛋白質，有時甚至根本不產生蛋白質。DNA 測序首先涉及分離和複製 DNA 片段以進行核苷酸分析。因此，PCR 是人類基因組計劃必不可少的工具，因為它可以快速輕鬆地為這種研究生成無限量的任何 DNA 片段。PCR 是一種直接的方法，可以區分單個基因中混亂的不同突變，每個突變都可能導致疾病，如杜氏肌營養不良。它還有助於醫生跟蹤特定癌症特徵的 DNA 異常的存在或不存在，以便他們儘快開始和停止藥物治療和放射治療。PCR 有望極大地改善骨髓移植供體和受體的基因匹配。該技術無與倫比的能力，即使是對最微量甚至古老和受損的 DNA 進行識別和複製，已被證明在法律領域，特別是刑事訴訟領域非常有價值。PCR 是法醫 DNA 測定的不可或缺的輔助手段——通常稱為 DNA 指紋識別。在犯罪現場發現的 DNA 痕跡也可以使用 PCR 擴增，從而提供足夠的 DNA 量與嫌疑人的 DNA 進行匹配。DNA 是一個極其穩定的分子，尤其是在受到空氣、光線和水的保護時。在這種情況下，大量的 DNA 片段可以儲存數千年或更長時間。因此，PCR 為擴增此類古代 DNA 分子提供了一種極佳的方法，以便可以對其進行分析。該技術還可用於擴增尚未分離和培養的微生物的 DNA。來自這些 PCR 產物的序列可以為生物體之間的進化關係提供相當大的見解。

PCR 的變體

由於 PCR 的高度適應性，許多基於原始 PCR 方法的新生化技術已經問世。一些常見的技術按字母順序列出如下。

等位基因特異性 PCR 是一種基於單核苷酸多型性 (SNP) 的克隆技術。這需要一個等位基因之間存在差異的 DNA 序列，並使用 3' 端包含 SNP 的引物。

組裝 PCR，更正式地說稱為聚合酶迴圈組裝 (PCA)，是一種透過將 PCR 應用於小的寡核苷酸並將它們雜交在一起合成長鏈 DNA 寡核苷酸的方法。整個過程包括兩組 PCR 反應。第一個反應利用正向和反向引物將具有互補序列的寡核苷酸片段退火在一起。第二個反應使用另一組引物來進行常規 PCR 反應，這將擴增第一個反應的結果。只有較大的寡核苷酸鏈被擴增，從而將它們與其他不完整的較短片段區分開來。一旦整個反應完成，就可以進行凝膠電泳來分離和識別已完成的鏈。

不對稱 PCR 是一種生物化學技術，它專注於擴增一條 DNA 鏈而不是另一條鏈。為此，執行正常的 PCR 反應，但使用與靶鏈反應的引物過量或不存在與互補鏈反應的引物。這種方法用於某些型別的法醫測序和探測，其中只有一種 DNA 鏈是首選。

菌落 PCR 是一種在載體（如大腸桿菌菌落）中擴增 DNA 以識別靶 DNA 的生物化學技術。該過程的第一步涉及使用無菌牙籤或移液器吸頭從培養皿中取出載體樣本。將樣品轉移到 PCR 主混合液或高壓滅菌水中，在那裡進行正常的 PCR 反應以確定菌落是否包含目標 DNA 片段或質粒。

數字 PCR 同時擴增數千個樣品。

解旋酶依賴性擴增使用恆定溫度，而不是迴圈透過變性、退火和延伸迴圈。DNA 解旋酶是一種酶，它解開 DNA 並用於代替熱變性。

熱啟動PCR 是一種PCR形式，其重點是最大限度地提高產物產量。為了實現這一目標，使用化學修飾來限制聚合酶活性，直到反應開始。這種限制減少了非特異性聚合酶擴增。接下來，反應本身是在極高的溫度下進行的，使用從嗜熱生物體獲得的聚合酶，例如來自海洋熱液噴口的古細菌。這些升高的溫度進一步防止非特異性聚合酶擴增，導致目標產物產量更高。

序列間特異性PCR 是一種用於DNA指紋識別的技術。它可以擴增特定區域，生成唯一的擴增片段指紋圖譜。

反向PCR 是一種經過設計的方法，用於繞過常規PCR的限制，常規PCR需要事先知道目標序列周圍的側翼序列。反向PCR的命名恰如其分，因為它可以用於確定目標鏈的側翼序列。但是，該方法也有自己的侷限性：必須已知一個內部序列才能執行它。

連線介導PCR 是一種用於DNA測序、基因組行走、DNA足跡分析的技術。該技術利用連線到所需DNA上的小DNA接頭和多個與接頭退火的引物。

甲基化特異性PCR (MSP) 檢測基因組DNA中CpG島的甲基化。DNA經亞硫酸氫鈉處理，並被PCR引物識別。使用兩種PCR來修飾DNA。一種引物識別具有胞嘧啶的DNA以擴增甲基化DNA，另一種引物識別具有尿嘧啶/胸腺嘧啶的DNA以擴增未甲基化DNA。

迷你引物PCR 允許PCR靶向更小的引物（小寡核苷酸）（由9-10個核苷酸組成）結合區域，並用於擴增保守的DNA序列。

多重PCR 是一種生化技術，其重點是透過在單個PCR反應中新增多個引物來同時擴增多個目標DNA產物。多重PCR是DNA檢測的首選方法，因為它允許分析樣本中的缺失、突變和多型性。

多重連線依賴探針擴增 (MLPA) 使用一對引物擴增多個靶標。

巢式PCR 是一種PCR形式，可最大限度地提高目標DNA片段擴增的準確性。巢式PCR包含兩個獨立的反應。第一個是正常的PCR反應，其中使用一對引物來擴增目標片段。第二個反應添加了第二對稱為“巢式引物”的引物，它們與第一個反應的產物結合並擴增它們。透過執行兩組PCR反應，該方法最大限度地提高了準確性，因為兩對引物都與錯誤的目標片段結合的可能性非常低。

重疊延伸PCR 允許構建具有插入的DNA序列，該序列插入超出引物長度限制的範圍。

PAN-AC 使用等溫條件進行擴增。

定量PCR (Q-PCR) 測量PCR產物的數量。它測量DNA、cDNA和RNA的起始量。它通常用於確定DNA序列是否存在以及它在樣本中的複製數。該技術使用熒光染料（例如TaqMan）來測量擴增產物的量。

逆轉錄PCR (RT-PCR) 是一種經過設計利用我們對逆轉錄如何從RNA形成互補DNA的知識的生化技術。RT-PCR分兩步進行。第一步，使用寡聚dT將目標RNA鏈逆轉錄成其互補DNA，寡聚dT替代了引物的作用。在第二步中，透過新增與DNA特異的引物來進行常規PCR反應，以幫助擴增目標序列。RT-PCR是一種高度靈敏的技術，它利用了RNA鏈（與它們的DNA對應物相比）的較小尺寸。RT-PCR是一種高度適用的技術。除了上述材料之外，該技術還可用於透過合成互補DNA來大量生產目標RNA，互補DNA隨後可以透過載體進行克隆。

降落PCR 是一種PCR技術，其重點是最大限度地提高目標產物產量。因此，它可以被視為熱啟動PCR方法的替代方法。為了實現其目標，該方法在高溫退火溫度下進行PCR反應，這減少了非特異性聚合酶擴增。換句話說，只有包含目標序列的片段才會被引物擴增。隨著片段被反覆擴增，溫度逐漸降低，直到確定只有目標片段保留下來。

通用快速行走 用於基因組行走和遺傳指紋識別。這是一種比普通單側PCR方法更特異的兩側PCR。

串聯重複序列變異數 (VNTR) PCR 靶向基因組中表現出長度變異的區域。基因型的分析包括透過凝膠電泳對擴增產物進行大小排序。分析較小的VNTR片段（短串聯重複序列，STR）是DNA指紋識別的基礎。

DNA聚合酶

Klenow片段 最初是從大腸桿菌的DNA聚合酶I（第一種用於PCR的酶）中獲得的。由於該聚合酶在高溫下不穩定，因此需要在每個迴圈中補充。它在PCR中不常用。

噬菌體T4 DNA聚合酶 最初用於PCR，但也會被熱破壞，並且具有比Klenow片段更高的保真度複製。

熱水棲熱菌 (Taq) 是常用的，並且是第一個用於PCR的耐熱（耐熱）聚合酶。這種酶從天然來源或從在大腸桿菌中表達的克隆基因中分離出來。

Stoffel片段 由Taq聚合酶的截短基因製成，並在E. coli中表達。這種酶缺乏5'-3'外切核酸酶活性，並且能夠擴增比其天然酶更長的靶標。

Faststart聚合酶 是Taq聚合酶的一種變體，需要強烈的熱活化。由於其低溫聚合酶活性，應避免非特異性擴增。

Pfu DNA聚合酶 從古細菌火球菌中分離出來。這具有校對活性。由於錯誤隨著PCR的進行而增加，因此在將產物單獨克隆用於測序或表達時，Pfu是首選。

Vent聚合酶 極耐熱，從熱球菌中分離出來。

Tth聚合酶 是一種來自嗜熱棲熱菌的耐熱聚合酶。這種聚合酶在存在Mn2+離子的情況下具有逆轉錄酶活性，允許從RNA靶標進行PCR擴增。

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