結構生物化學/酶催化機制/BamHI
BamHI( from BAcillus amyloli) 是一種 II 型限制性內切酶，源自枯草芽孢桿菌，具有識別短序列 DNA 並特異性地將其在靶位點切割的能力。為了瞭解這些限制性內切酶如何與其特定序列結合，BamHI 成為一個受歡迎的研究目標。透過結晶 BamHI 內切酶，科學家瞭解了 DNA 結合蛋白如何從細胞中各種非特異性序列中選擇其特定靶標。
為了使限制性內切酶與它們的靶序列結合，它們必須首先與非特異性 DNA 結合。據信這些非特異性內切酶-DNA 複合物在其內切酶-DNA 介面處更具水合性，透過靜電相互作用穩定，並且在結合過程中導致低熱容變化。在沒有與非特異性序列發生強相互作用或結合的情況下，這些弱相互作用有助於這些內切酶的滑動能力。這些內切酶不是穩定地與某個序列結合，而是沿著序列滑動，直到找到特定的序列匹配。以下是對兩位科學家Hector Viadiu 和Aneel K. Aggarwal 在 2000 年進行的一項研究的總結。
本研究的目的是確定 BamHI 如何與其非特異性 DNA 序列結合並與其靶序列相互作用。BamHI 傾向於在特定的切割位點與以下序列結合，如下所示，其中直線表示切割位點。
作為一種限制性內切酶，特定序列的改變，即使是像一個鹼基對一樣小的改變，也足以使序列變得非特異性。實驗首先從溶液中結晶具有 DNA 序列 5'-ATGAATCCATA-3' 的非特異性晶體。在該序列中，GAATCC 與 BamHI 的靶切割類似。研究揭示了 BamHI 在這種類似序列存在下的結構。
BamHI 是一種涉及三種不同狀態的催化機制。第一種狀態，即反應發生之前，稱為預反應狀態。接下來是中間狀態，稱為過渡狀態。最後一種狀態是反應後狀態。以下是該機制發生步驟的摘要：存在一個水分子和一個穀氨酸。這使得穀氨酸能夠奪取水的質子並提取質子。這會留下一個羥基，該羥基將對磷酸原子進行親核攻擊。由於存在兩種金屬，負電荷會被穩定。然後，將會有一個五價磷酸鹽，並且額外的負電荷會被金屬離子穩定。磷酸鹽將有一個額外的氧原子，導致溶液中的水錶現為供體。這允許磷酸鹽恢復其配位的趨勢。最後，氧原子將攻擊水分子，質子將轉移到離去基團，導致反應後狀態。總體而言，在比較預反應狀態和反應後狀態時，觀察到磷酸鹽的輕微移動。
儘管 DNA 序列相似，但 BamHI 在特異性複合物中的行為完全不同。不僅 BamHI 二聚體的底部鬆散，而且酶也相對於其軸線傾斜了 20 度。因此，鹼基對的替換不僅會影響該特定鹼基對的相互作用，還會影響整個序列和 BamHI 內切酶的構象。構象的變化在圖 1 中有所體現。在特異性複合物中，一個單體 C 末端的α螺旋展開以與另一個單體相互作用。然而，當目標序列被改變時，複合物變得非特異性。在非特異性複合物中，這些單體不會展開並相互作用。由於沒有構象變化，來自 BamHI 序列的氨基酸遠離 DNA 並且不參與任何結合。因此，切割不會發生。
BamHI 透過兩種方式裂解 DNA。首先，BamHI 透過與二價陽離子共結晶來裂解 DNA。例如，BamHI 將與兩個二價金屬結合。其次，BamHI 透過直接與 DNA 本身結合來裂解 DNA。在活性位點，酶的電荷為負。金屬位於活性位點和 DNA 之間。該反應的抑制劑包括鈣。BamHI 透過向第二個水分子捐贈一個質子來裂解磷酸二酯鍵。存在一個預反應位點和一個反應後位點，指示哪些序列已被裂解。磷酸鹽位於 5' 方向，而氧原子位於 3' 方向。
只有當 BamHI 檢測到特定 DNA 序列時，才會觸發 BamHI 的構象變化。否則，BamHI 的活性位點殘基朝外，不會與非特異性序列相互作用或結合。BamHI 內切酶的這種特異性至關重要，因為它可以避免在類似 DNA 序列處發生致命的裂解。
每次細菌複製 DNA 時，都會對其進行甲基化。BamHI 等限制性內切酶無法裂解被甲基化的 DNA 序列。然而，來自病毒的 DNA 不會被甲基化，因此它們最終會被 BamHI 裂解。如果細菌想要存活，它們必須能夠識別哪些序列是被甲基化的。當酶識別到正確的位點時，DNA 就會靠近。當 DNA 改變構象時，它會遠離活性位點，因此不會進行催化。許多殘基負責催化，並且許多殘基靠近活性位點，以便識別特定的底物並確保它們是正確的底物。
BamHI 能夠從數百萬個可能的序列池中識別出特定 DNA 序列，方法是簡單地與任何 DNA 結合。然後，它們沿著 DNA 鏈滑動以找到正確的序列。當它找到特定的序列時，它將改變構象幷包圍 DNA。
1. Viadiu H, Kucera R, Schildkraut I, Aggarwal AK, "限制性內切酶 BamHI 與非特異性 DNA 的結晶。" J Struct Biol 1(81-5):, 2000。
2. Viadiu, Hector. 催化機制示例。生物化學講座。2012 年 12 月 3 日