結構生物化學/真核重組
細菌和病毒基因並非唯一可以引入宿主細胞的序列。真核基因可以被引入細菌以產生所需的蛋白質產物。也有可能將 DNA 引入高等生物,這已導致基因治療。雖然真核基因的操作具有許多可能性和優勢,但它也是爭議的來源。
大多數真核 DNA 中間插入了內含子和外顯子,它們會打斷基因,無法被細菌表達。克服這種障礙的方法是利用與 mRNA 互補的 DNA(mRNA 剪接內含子)。形成互補 DNA 的關鍵是逆轉錄,它合成與 RNA 模板互補的 DNA 鏈。可以製作包含細胞中所有 mRNA 的互補 DNA,將其插入載體,然後將其插入細菌(這種集合稱為 cDNA 文庫)。
互補 DNA 分子可以插入有利於它們在宿主中高效表達的載體中,稱為表達載體。為了最大限度地提高轉錄,cDNA 被插入載體中啟動子的附近。克隆可以根據它們在細菌中指導合成外源蛋白質的能力進行篩選。
細菌缺乏進行翻譯後修飾的必要酶。因此,許多真核基因只能在真核宿主細胞中正確表達。重組 DNA 分子可以透過多種方式被引入動物細胞。首先,被磷酸鈣沉澱的外源 DNA 分子被動物細胞吸收。另一種方法涉及將 DNA 微量注射到細胞中。第三種方法利用病毒,特別是逆轉錄病毒,因為它們通常不會殺死宿主,並且會隨機整合到宿主染色體 DNA 中,以將新基因引入動物細胞。
莫洛尼鼠白血病病毒接受長達 6 千鹼基對的插入片段,並且由該載體引入的一些基因可以高效表達。牛痘病毒是一種大型含有 DNA 的病毒,在哺乳動物細胞的細胞質中複製,在那裡它會關閉宿主細胞的蛋白質合成。桿狀病毒感染昆蟲細胞,這些細胞可以很容易地培養。
什麼是電穿孔?它是透過幫助極性分子插入宿主細胞的細胞膜,將外源 DNA 引入植物細胞的方法。該過程是引發強電場,使質膜對極性分子具有滲透性,從而使這些分子能夠透過細胞。
第一步:透過新增纖維素酶去除纖維素壁,生成原生質體。
第二步:應用電脈衝來擾亂疏水膜,使其對質粒 DNA 具有滲透性,使其能夠進入。
第三步:然後允許細胞壁重新形成。
電穿孔:腫瘤誘導質粒 (Ti 質粒) 攜帶指示細胞轉變為腫瘤狀態的指令。Ti 質粒可以透過將自身整合到受感染植物細胞的基因組中 (T-DNA) 來將外源基因傳遞到一些植物細胞中。外源 DNA 可以透過電穿孔被引入植物細胞。去除纖維素壁,生成原生質體。然後將電脈衝施加到原生質體和質粒 DNA 的懸浮液中。強電場使膜對大分子暫時具有滲透性,質粒 DNA 分子進入細胞。當細胞壁重新形成時,植物細胞變得可行。
基因槍:將微彈射向目標細胞是最有效的植物細胞轉化方法。
轉基因生物創造了具有有益特徵的植物,例如能夠在貧瘠的土壤中生長、對氣候變化的抵抗力、對害蟲的抵抗力以及營養強化。然而,由於未知的副作用,它們的使用存在很大爭議。