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結構生物化學/真核重組

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細菌和病毒基因並非唯一可以引入宿主細胞的序列。真核基因可以被引入細菌以產生所需的蛋白質產物。也有可能將 DNA 引入高等生物,這已導致基因治療。雖然真核基因的操作具有許多可能性和優勢,但它也是爭議的來源。

克隆真核 DNA

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大多數真核 DNA 中間插入了內含子和外顯子,它們會打斷基因,無法被細菌表達。克服這種障礙的方法是利用與 mRNA 互補的 DNA(mRNA 剪接內含子)。形成互補 DNA 的關鍵是逆轉錄,它合成與 RNA 模板互補的 DNA 鏈。可以製作包含細胞中所有 mRNA 的互補 DNA,將其插入載體,然後將其插入細菌(這種集合稱為 cDNA 文庫)。

互補 DNA 分子可以插入有利於它們在宿主中高效表達的載體中,稱為表達載體。為了最大限度地提高轉錄,cDNA 被插入載體中啟動子的附近。克隆可以根據它們在細菌中指導合成外源蛋白質的能力進行篩選。

高等生物中的重組 DNA

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細菌缺乏進行翻譯後修飾的必要酶。因此,許多真核基因只能在真核宿主細胞中正確表達。重組 DNA 分子可以透過多種方式被引入動物細胞。首先,被磷酸鈣沉澱的外源 DNA 分子被動物細胞吸收。另一種方法涉及將 DNA 微量注射到細胞中。第三種方法利用病毒,特別是逆轉錄病毒,因為它們通常不會殺死宿主,並且會隨機整合到宿主染色體 DNA 中,以將新基因引入動物細胞。

莫洛尼鼠白血病病毒接受長達 6 千鹼基對的插入片段,並且由該載體引入的一些基因可以高效表達。牛痘病毒是一種大型含有 DNA 的病毒,在哺乳動物細胞的細胞質中複製,在那裡它會關閉宿主細胞的蛋白質合成。桿狀病毒感染昆蟲細胞,這些細胞可以很容易地培養。

植物細胞改造

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檔案:電穿孔.jpg
電穿孔

什麼是電穿孔?它是透過幫助極性分子插入宿主細胞的細胞膜,將外源 DNA 引入植物細胞的方法。該過程是引發強電場,使質膜對極性分子具有滲透性,從而使這些分子能夠透過細胞。

第一步:透過新增纖維素酶去除纖維素壁,生成原生質體。

第二步:應用電脈衝來擾亂疏水膜,使其對質粒 DNA 具有滲透性,使其能夠進入。

第三步:然後允許細胞壁重新形成。


電穿孔:腫瘤誘導質粒 (Ti 質粒) 攜帶指示細胞轉變為腫瘤狀態的指令。Ti 質粒可以透過將自身整合到受感染植物細胞的基因組中 (T-DNA) 來將外源基因傳遞到一些植物細胞中。外源 DNA 可以透過電穿孔被引入植物細胞。去除纖維素壁,生成原生質體。然後將電脈衝施加到原生質體和質粒 DNA 的懸浮液中。強電場使膜對大分子暫時具有滲透性,質粒 DNA 分子進入細胞。當細胞壁重新形成時,植物細胞變得可行。

基因槍:將微彈射向目標細胞是最有效的植物細胞轉化方法。

轉基因生物創造了具有有益特徵的植物,例如能夠在貧瘠的土壤中生長、對氣候變化的抵抗力、對害蟲的抵抗力以及營養強化。然而,由於未知的副作用,它們的使用存在很大爭議。

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