結構生物化學/熒光蛋白
熒光是光（例如可見光）被分子吸收並在更長波長處重新發射以產生獨特顏色的過程。這是一種基於原子或分子中電子激發的物理現象；發射在更長的波長處。熒光使我們能夠看到事物在細胞中的相互作用方式，以及它們的位置和所走的路徑。
熒光蛋白最初是從水母Aequorea Victoria中提取出來的。它們對細胞生物學的研究至關重要。熒光蛋白包含各種顏色變體，它們在不同的波長處發出不同的顏色，因此充當有價值的探針，可用於活細胞成像。這些蛋白質可以用作體內標記物，用於全身成像和癌症檢測，以及在蛋白質融合可以用來監測細胞內動力學和轉錄方面的細胞器中。有助於蛋白質熒光特性的重要方面是它的結構，它由不同的氨基酸組成，具體取決於蛋白質和區域性微環境。已經建立了各種熒光蛋白衍生物，用於各種標記，其中最廣泛使用的是綠色熒光蛋白，羅傑·齊恩（來自加州大學聖地亞哥分校的科學家）因其研究而獲得了諾貝爾和平獎。
瞭解蛋白質結構可以讓人進一步瞭解蛋白質的功能。對於熒光蛋白的結構來說，情況就是這樣。對於綠色熒光蛋白，它是由一個β桶結構組成，該結構由一個β螺旋和α螺旋組成，它們包圍著生色團。生色團是分子中負責其顏色的部分。螺旋的生色團由三個氨基酸形成，它們形成一個三肽Ser65-Tyr66-Gly67。氨基酸殘基的環化是形成咪唑烷酮環的原因。但是，三肽的一個重要特性是，氨基酸序列不是導致熒光的內在特性，因為在其他沒有熒光的蛋白質中也發現了相同的氨基酸序列。咪唑烷酮環的進一步氧化會導致環與Tyr-66偶聯，在熒光方面促成蛋白質的成熟。生色團的一個關鍵組成部分也是它處於兩種狀態。生色團的一種狀態是質子化狀態或占主導地位的狀態，其激發最大值是395奈米。生色團的另一種狀態是未質子化狀態，其激發最大值是475奈米。由於綠色熒光蛋白的生色團的複雜性，該分子可以容納修飾。一個重要的特徵是，β桶中氨基酸殘基的緊密堆積是穩定的，導致高熒光量子產率。由氫鍵貢獻的緊密蛋白質結構也對pH值、溫度和變性劑（如尿素）具有抵抗力。
黃色熒光蛋白
這些熒光蛋白以生色團中一個氨基酸殘基的突變為代表。發現綠色熒光蛋白（GFP）中發現的酪氨酸發生了突變，導致偶極矩的穩定以及激發/發射光譜波長的變化，從而導致黃色熒光。此外，發現黃色熒光蛋白在生色團附近有一個新的蘇氨酸殘基 203。黃色熒光蛋白的進一步修飾可以增強蛋白質的亮度，這使其成為增強型黃色熒光蛋白 (EYFP) 的重要工具。這些蛋白質源自水母Aequorea Victoria，並經過修飾以建立與原始綠色熒光蛋白不同的熒光發射。
黃色熒光蛋白TagYFP是一種明亮的黃色熒光，推薦用於蛋白質定位和相互作用研究中的蛋白質標記。它也可能用於細胞和細胞器標記以及追蹤啟動子活性，儘管更喜歡 TurboYFP 和 Phl-Yellow 蛋白。它是一種單體蛋白，已成功用於融合，並且是在水母Aequorea macrodactyla中發現的類似 GFP 的蛋白質的基礎上開發的。TagYFP 具有快速成熟階段以及高 pH 穩定性和光穩定性。它的高 pH 穩定性使其比 EYFP 更穩定，而它的快速成熟使其能夠產生更亮的熒光訊號。TagYFP 也已被證明可以產生穩定的轉染細胞系。
藍色和青色熒光蛋白
藍色和青色熒光蛋白是由位於生色團中的 Tyr 66 殘基的修飾產生的。將 Tyr 轉換為組氨酸會導致在 450 奈米波長處發出藍色熒光。另一種修飾是將 Tyr 轉換為色胺，導致在約 480-500 奈米波長處產生不同的熒光。此外，使用這些熒光蛋白的遺傳標記表達為 TagBFP。這種蛋白質的一個優勢是它易於表達和檢測，可以在多種生物體中檢測到。用 TagBFP 表達載體瞬時轉染的哺乳動物細胞在轉染後 10-12 小時內會發出明亮的熒光訊號。沒有觀察到細胞毒性作用和可見的蛋白質聚集。TagBFP 在融合中的效能已在 β-肌動蛋白和 α-微管蛋白模型中得到證明。它可以用於與綠色、黃色、紅色和遠紅色熒光染料的多色標記應用。然而，這些修飾的一個問題是，它們需要二次突變來增加摺疊效率和亮度。幸運的是，基因組修飾不會危及生命。
紅色熒光蛋白
已衍生出各種紅色熒光蛋白衍生物，希望找到一種蛋白質，其熒光能力超過或等於 GFP（綠色熒光蛋白）。一種蛋白質衍生物來自珊瑚Dicosoma striata，也稱為 DSRED。當它成熟時，發現該蛋白質的發射光譜約為 583 奈米。DSRED 的進一步修飾導致形成 DSRED2，該修飾在肽末端具有突變，可以防止蛋白質聚集的形成並降低毒性水平。此外，發現 DSRED2 也與 GFP 更相容。這些蛋白質也以其四聚體結構為代表。
'綠色熒光蛋白' 綠色熒光蛋白 (GFP) 由大約 200 多個氨基酸殘基組成。這種蛋白質在藍光照射下會發出綠色熒光。GFP 主要從海洋生物體中分離出來：維多利亞多管水母。這種 GFP 有三個主要的激發峰值。一個強烈的峰值在 395 奈米波長，另一個較小的峰值在 475 奈米，而發射峰值在 509 奈米，這賦予了該蛋白質鮮明的亮綠色。另一種來自海羽的生物體在 498 奈米附近有另一個激發峰值。GFP 基因對於生物感測和報告基因表達的位置至關重要。它可以透過育種、體外注射或轉化過程轉入其他生物體的基因組。GFP 基因被引入各種細菌、酵母、真菌和其他多細胞生物體中。GFP 成為研究工具的故事始於 1992 年，當時哥倫比亞大學的馬丁·查爾菲證明，製造 GFP 的基因在從水母基因組中移除並轉移到其他生物體的細胞中時產生了熒光蛋白。查爾菲，一位發育生物學家，首先將該基因放入細菌和線蟲中，創造了這些動物的“發光”版本。馬丁·查爾菲、下村修和錢永健因其發現和開發綠色熒光蛋白於 2008 年 10 月 10 日獲得了 2008 年諾貝爾化學獎。從那時起，研究人員已將 GFP 基因轉移到許多其他生物體中，甚至包括在實驗室培養皿中生長的人類細胞中。GFP 在天然色素中獨一無二，因為它能夠透過大氣條件自動催化自身的生色團。透過這種方式，單一蛋白質既充當底物又充當酶。其他天然色素的產生需要多種酶。生物技術利用了 GFP 的這種獨特特性，將其用作基因表達和蛋白質定位的體內標記。單體熒光蛋白變體
熒光蛋白最初在其自然狀態下以二聚體、四聚體和寡聚體的形式存在。此外，熒光蛋白在細胞區室中形成二聚體的理論可能性，這是由於可能的高蛋白質濃度促成了二聚體化。因此，一直都在尋求使用單體熒光蛋白變體。然而，一個問題是，前幾個單體熒光蛋白的熒光能力降低了。此外，單體的產生需要對結構進行大約 30 個氨基酸變化。但是，這些蛋白質的開發正在改進，這些蛋白質的量子產率和光穩定性都得到了提高。
熒光標籤用於標記蛋白質、DNA 和抗體等分子。熒游標記利用熒光團與目標分子上的官能團反應。透過這種型別的分子標記產生探針。蛋白質印跡分析識別和分離蛋白質，因此這些熒光標籤至關重要。尺寸排阻色譜法去除目標分子上的熒光團。熒光染料可用於指定細胞中存在的哪個細胞器，以便區分其獨特的結構並進一步探索其各自的功能。這些標籤和染料在顯微鏡和反向光漂白中很重要，因為它們對活細胞的危害小於量子點。熒光染料具有疏水性，因此在使用染料分離分子時使用特定的染料柱。
示例：蛋白質印跡分析
蛋白質印跡的目的是根據蛋白質結合特定抗體的能力來定位和確定蛋白質。蛋白質印跡分析可以檢測混合物中眾多蛋白質中感興趣的蛋白質。完成蛋白質印跡後，從該過程中獲得的資訊是蛋白質的大小和蛋白質的表達量。蛋白質印跡分析可以對任何蛋白質樣品進行，從細胞到組織，再到體外合成的重組蛋白。蛋白質印跡依賴的條件是用於探測目標蛋白質的抗體的質量。蛋白質印跡中使用的抗體必須對感興趣的蛋白質具有特異性。
示例：綠色熒光蛋白 (GFP) 在暴露於藍光時會變成綠色。 關於 GFP 的資訊
X 射線熒光顯微鏡
硬 X 射線熒光顯微鏡可用於研究完整未染色生物組織中的微量金屬分佈。
微量金屬元素是許多生命形式不可或缺的元素。金屬有助於催化功能，有時甚至在細胞內發揮結構作用。例如，鋅指結構域，其中鋅離子有助於結合核酸和蛋白質。金屬以其對人類健康和疾病的重大影響而聞名。因此，對這些微量元素的研究可以提供關於金屬蛋白功能和途徑的重要資訊和推理。這些研究甚至可以找到定量研究這些微量元素的細胞內分佈的治療方法。
這些 X 射線熒光已被用於建立斷層掃描影像，以視覺化 10 微米細胞的結構。儘管使用這些高穿透 X 射線進行斷層掃描非常有用，但也有一些限制會影響實驗持續時間和影像的準確性。由於 X 射線熒光顯微鏡的這些侷限性，一直都在進行研究以開發更好的 X 射線解析度、探測器速度、低溫環境以及輔助訊號的追求。因此，未來將在 X 射線熒光斷層掃描中出現許多有益的新方法。
硬 X 射線熒光，也稱為 XRF，顯微鏡是追蹤各種生物系統中微量金屬分佈的有用工具。對於銅、鋅和其他相關微量元素等過渡金屬，XRF 在 150 奈米的空間解析度下提供了阿托克級靈敏度。如今，已能夠同時繪製 10-15 種元素的圖譜。元素的同時對映導致精確的元素共定點陣圖。
硬 X 射線熒光的應用進一步改進了結構視覺化，但出現了一些技術挑戰，導致二維和低解析度的實現。目前的進展使科學家能夠克服一些最主要的限制，現在科學界能夠建立亞 500 奈米解析度的 XRF 斷層掃描。具有這種解析度的斷層掃描可以在元素特異性領域提供極端的細節。這些 XRF 斷層掃描的最新進展肯定會很快被利用。正在進行的其他開發包括低溫顯微探針，它們能夠適應冷凍水合標本。
X 射線熒光過程非常適合量化微量元素。XRF 獨特之處在於它不依賴於人工染料或熒光團來確定蛋白質的結構，而是透過將分子暴露於粒子（電子和質子）或 X 射線束，可以激發 X 射線熒光。使用 X 射線激發，軔致輻射背景變得不必要，從而使 WRF 顯微鏡能夠顯示出高空間解析度。由於 X 射線穿透使科學家能夠獲得數十微米的樣品厚度，因此 XRF 顯微鏡是形成生物樣品斷層掃描視覺化的理想方法。
由於 XRF 斷層掃描中涉及的許多技術挑戰和分析複雜性，該方法尚未得到普遍應用。儘管如此，最近的進展已將 3D 解析度提高到幾個 100 奈米，適用於尺寸高達 10 微米的標本。這意味著可以使用高空間解析度視覺化多個元素的 3D 元素圖譜。XRF 及其最新進展擁有光明的未來。結合生物、環境、材料和地質界的需求，XRF 看起來非常有前景。
XRF 斷層掃描
術語“斷層掃描”源於希臘語，意思是“切片成像”，這意味著它是一種從標本內部單一切片獲取資料的技術。從傾斜角度對標本切片進行 3D 重建。考慮到連續切片是斷層掃描的直接方法，重建任務可能非常繁重且耗時。這種直接方法，即實際進行物理切片，會導致明顯的偽影，這被定義為整體上被視為人工物件的物體。作為對物理切片的一種替代方法，可以使用非破壞性技術，因為它們減少了標本製備要求，並且執行起來也容易得多、簡單得多。與其他斷層掃描方法相比，只有 XRF 顯微斷層掃描能夠以與生物學直接相關的程度繪製微量元素分佈圖。
全場斷層掃描
最近，X 射線熒光斷層掃描已透過使用全場成像和結構化探測器方法得到證明。然而，這些新穎的全場成像和結構化探測器方法也有其優缺點。這些新興技術的空間解析度在 2 到 200 微米之間，靈敏度水平在 100ppm 到百分比水平之間。它們還具有廣泛的元素對比度範圍，使其不適合常規用於研究生物標本的細胞。
投影斷層掃描
投影斷層掃描是一種使用標本投影作為其輸入資料的斷層掃描重建演算法的技術。有一個能量色散探測器，它對沿柱產生的任何訊號敏感。在一定位置範圍內測量 2D 資料，在多個角度進行測量，並且使用分析方法幫助構建標本的 3D 地圖。使 X 射線熒光顯微照片區別於其他斷層掃描方法的是其自吸收效應。這包括標本對熒光的重新吸收和入射光束的吸收。當使用低熒光能量進行 X 射線顯微照片時，對於厚標本，自吸收效應會增加。
自吸收對 XRF 斷層掃描有重大影響。為了解決這個問題，需要良好的校正演算法以確保影像清晰度，它們還會擴充套件標本尺寸域，以降低熒光能量並保持資料準確性。吸收圖可用於估計不同熒光能量下的自吸收。使用能量色散探測器，記錄了非彈性和彈性訊號。這些非彈性和彈性訊號提供了訪問通常難以獲得的主要輕元素分佈的途徑。
共聚焦斷層掃描
共聚焦斷層掃描被稱為 XRF 斷層掃描的直接空間方法，當軸向解析度低於 5 微米時。在這種方法中，訊號僅來自照明柱的一小部分，因為準直器限制了能量色散方向的視野。
共聚焦斷層掃描只能直接訪問標本的一小部分割槽域。不幸的是，這可能會使它難以針對標本中感興趣的特徵。研究人員提出了另一種解決此問題的方法：使用投影斷層掃描進行低解析度概述，然後進行感興趣區域的共聚焦研究。
結構生物學最大的目標之一是瞭解細胞如何運作，以及它們如何感知和處理外部和內部訊號。 遺傳編碼的熒光蛋白 (FP) 和熒光感測器可以幫助研究人員視覺化細胞過程是如何運作的。 細胞是所有生命系統的基本組成部分，依賴於複雜的內部過程。 這些過程在微米尺度上在不同的膜隔室和細胞骨架位置發生。 熒光成像使用來自水母維多利亞水母及其近緣種的綠色熒光蛋白 (GFP) 可以幫助科學家進一步探索這些細胞過程。 GFP 由於其熒光，或其產生與照射光不同顏色的光的容量，可以作為重要的分子成像工具。 GFP 和熒光可以隨著時間的推移監測細胞過程。 此外，GFP 由單個可移植的 DNA 序列編碼，該序列可以很容易地與感興趣的蛋白質融合並在活細胞內表達。 在 GFP 之前，研究人員依靠熒光抗體技術來檢查蛋白質和核苷酸序列，但這隻能在死亡的、固定的細胞或組織切片上進行。
隨著 GFP 越來越受歡迎的分子成像工具，GFP 的改進和進步也隨之出現。 GFP 的誘變導致其亮度和摺疊效率增加，以及其寡聚化減少。 誘變也產生了可光活化或可光轉換的 GFP 形式。 發現 GFP 只是更大的同源熒光蛋白家族中的一員，主要來自海洋珊瑚，由於結構和環境的變化，它們具有不同的顏色。 對這些物種中 FP 的定向誘變產生了 FP 調色盤，涵蓋了整個可見光譜範圍。 多種顏色允許對細胞內多組蛋白質進行同時成像。
GFP 的發展最終催生了不同的成像技術，例如光漂白後熒光恢復、熒光相關光譜、FRET、熒光交叉相關光譜、全內反射顯微鏡、熒光壽命成像和光活化定位顯微鏡 (PALM)。 這些成像技術允許對細胞功能進行體內分析。
例如，FP 報告基因可用於監測標記的訊號分子的行為及其組織，以及檢測訊號通路中每個組分的特定池。 這可以透過光漂白來完成，其中使用高強度雷射脈衝光漂白細胞的某個區域，並透過延時顯微鏡記錄未漂白分子從相鄰區域移動到漂白區域的過程。 當用遺傳編碼的 FP 標記時，細胞內蛋白質的動力學特性，例如其在隔室之間的運動，也可以看到。 在光漂白和光活化中，FP 融合蛋白的整體功能可以在不干擾其他途徑或細胞功能的情況下確定。
FP 在熒光成像方法中的使用也使蛋白質-蛋白質相互作用能夠得到解決。 這可以透過 FRET 測量來完成，FRET 測量允許即時繪製細胞內蛋白質-蛋白質相互作用的圖譜。 在 FRET 中，一個報告基因是供體熒光團，另一個報告基因是波長更長的受體熒光團。 讀出是能量從供體到受體的轉移。 透過結合 GFP 變體，這些報告基因可以附著在不同的蛋白質上以測試它們的相互作用。
進一步開發的過程包括使用探針來監測 GTP 水解和細胞週期事件。 一種策略是使用可以誘導形成二聚體的小分子。 探針可用於在細胞的特定時間和地點驅動特定的生物活性。 另一種策略涉及光誘導開關，它利用光來啟用訊號分子。 探針還可以與鋅和一氧化氮指示劑發生反應，這些指示劑是驅動生理過程或引發病理的無機物質。
報告基因技術允許對活體系統中的生化過程進行即時視覺化，並提供了一種獲得對細胞內訊號網路的空間組織和調節的見解，這些網路是生物過程的基礎。
已經開發了分子成像方法來分析磷酸化在活細胞中的作用。 這些方法涉及使用最近引入的熒光報告基因，這些報告基因可以對細胞中的磷酸化進行高解析度成像。 這種分子成像為我們提供了對訊號網路的時間和細胞定位的理解和見解。 在這些熒光成像技術發展之前，激酶作用的測量通常透過分析酶活性的事後 (意味著追溯) 來完成，透過免疫沉澱或免疫細胞化學技術。 延遲的測量並不像以前那樣有效，因為它們存在特異性問題，並且無法即時報告激酶作用。 此外，在激酶作用後獲取資訊會導致丟失僅在活細胞中發現的關鍵資訊。 因此，已經開發了熒光報告基因，用於在複雜混合物或活細胞中進行即時分析。
肽生物感測器通常用於測量體外磷酸化事件，具有良好的解析度，並具有活細胞成像的潛力。 這些生物感測器遵循合成熒光團進入肽或蛋白質的基本設計。 這些性質在磷酸化後發生變化，這使得可以透過波長變化 (量子產率增加、減少或兩者兼而有之) 進行分析。 生物感測器主要有四種類型：環境敏感型、深度猝滅型、自報告型或金屬螯合增強型。
環境敏感型生物感測器通常具有與磷酸化肽複合的磷酸特異性氨基酸結構域。 這種型別的生物感測器通常用於 Ser/Thr 或 Tyr 磷酸化。 當被啟用時，熒光會增加七倍。
深度猝滅生物感測器具有非共價連線的猝滅劑，該猝滅劑遮蔽熒光，直到磷酸化。 當分子被磷酸化時，生物感測器獲得磷酸特異性氨基酸，將猝滅劑與熒光團分離，導致熒光增加。 這通常導致熒光增加約 64 倍。
自報告生物感測器用於檢測酪氨酸磷酸化。 例如，酪氨酸可用於透過 π-π 堆積相互作用來猝滅熒光團。 當磷酸化時，猝滅消失，熒光增加五倍。
最後，金屬螯合增強型生物感測器使用非天然氨基酸 Sox、螯合增強型熒光團以及一系列針對蛋白質激酶活性的生物感測器，這些生物感測器對 Mg2+ 有反應。 這些通常在磷酸化後熒光增加八倍。
這些生物感測器通常用於體外激酶測定，並允許檢測初始滯後階段。 這些生物感測器通常還監測多種激酶的活性。 還有可能使用這些生物感測器來分析活細胞測定[檢查拼寫]，但這些更困難。 雖然這些方法對於分析蛋白質激酶很好，但由於它們依賴於專用裝置，而且肽的不穩定性和細胞擾動可能發生，因此它們並沒有像人們認為的那樣被廣泛採用。
FRET (代表 Förster (熒光) 共振能量轉移) 是一種描述蛋白質之間能量轉移的機制。 大多數成像技術在將生物感測器匯入活細胞時存在困難，或者存在限制其使用的侷限性。 基於 FRET 的報告基因通常克服了進入細胞的困難，因為它可以讓細胞自行製造生物感測器。 這些報告基因是遺傳編碼的，可以作為 DNA 轉移到細胞中。 這些遺傳編碼生物感測器的一個顯著例子是 GFP (綠色熒光蛋白)。 FRET 的變化可以看作是熒光團熒光發射率的變化；這通常是供體和受體熒光團發射之間的變化。
FRET 成像透過使用 FLIM (熒光壽命成像顯微鏡) 來完成供體的光化學性質，FLIM 檢測到存在受體的情況下供體 FRET 對的熒光衰減縮短。 這是有利的，因為壽命測量與熒光團濃度和光漂白無關，並且允許區分實際的 FRET 效率和探針濃度。
選擇 FRET 對以產生最大的動態範圍。 選擇結構域基於要由生物感測器檢測的磷酸氨基酸。 生物感測器的底物部分控制著報告基因的特異性。 這通常是一個短的共有肽，可以被目標激酶特異性識別和有效磷酸化，但對其他激酶來說是惰性的。 該方法已經產生了大量成功遺傳編碼的生物感測器。 這些還被修改為包含其他特徵，例如靶向細胞特定區域的序列或在細胞內生成更多代的生物感測器。
這些基於 FRET 的生物感測器為我們提供了一種比以前更有效、更有效地對活細胞中的磷酸化進行成像的方法。
與基於肽的生物感測器相比，基因編碼的報告蛋白可以提供足夠的靈敏度，並且能夠提供關於磷酸化和訊號通路調控的更多有用資訊。這些報告蛋白可用於研究特定的激酶並影響其活性。還可以將特定報告蛋白靶向，以發現特定蛋白磷酸化與細胞其他特徵之間的關聯。
激酶報告蛋白最令人興奮的應用之一是透過高通量化學篩選。這可以幫助製藥公司，因為報告蛋白可以確保化合物能夠有效地進入細胞並提供蛋白質抑制的動力學資訊。這是一個重大的改變，因為這些篩選通常是在體外進行的，目前尚不清楚這些化合物是否可以靶向細胞內的激酶。透過使用細胞內激酶報告蛋白，研究人員已經能夠鑑定出幾種新型的蛋白激酶A (PKA) 抑制劑。所有這些都是透過分析熒光共振能量轉移 (FRET) 完成的。
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