結構生物化學/克雷布斯迴圈（檸檬酸迴圈）
檸檬酸迴圈有八個步驟。
檸檬酸迴圈的另一個名稱是三羧酸 (TCA) 迴圈或克雷布斯迴圈。檸檬酸迴圈是細胞的中心代謝核心。它是氧化（換句話說，是收集高能電子）——例如碳水化合物、脂肪酸和氨基酸——的最終共同途徑，它們透過進入迴圈作為乙醯輔酶 A (CoA) 來進行。該反應發生線上粒體內部。它非常有效，因為它可以產生大量的 NADH 和 FADH。檸檬酸迴圈提供了有氧人體細胞使用的能量的絕大部分（90%）。透過作為細胞呼吸的第一階段，檸檬酸迴圈產生的高能電子反過來被用於氧化磷酸化以還原 O2，產生質子梯度，並隨後合成 ATP。
碳水化合物主要透過糖酵解被加工成丙酮酸。取決於生物體，丙酮酸在厭氧條件下被轉化為乳酸或乙醇。透過嵌入線粒體膜中的特定載體蛋白，丙酮酸在有氧條件下被轉運到線粒體中。然後，丙酮酸被丙酮酸脫氫酶複合物氧化脫羧，以便線上粒體基質中形成乙醯 CoA。該反應如下所示
丙酮酸 + CoA + NAD+ → 乙醯 CoA + CO2 + NADH + H+
這是一個不可逆反應，它將糖酵解和檸檬酸迴圈聯絡在一起。如所示，CO2 由丙酮酸脫氫酶複合物產生，它以 NADH 的形式捕獲高轉移勢電子。因此，丙酮酸脫氫酶與檸檬酸迴圈本身的反應有關。丙酮酸脫氫酶複合物由三種不同的酶組成。它的複合物由同源複合物家族的成員組成，其中包括檸檬酸迴圈酶 α-酮戊二酸脫氫酶複合物。這些複合物非常大，甚至比核糖體還大，其分子量介於 400 萬到 1000 萬道爾頓之間。
- 乙醯-CoA 是有氧呼吸中丙酮酸脫氫酶複合物的主要產物，它啟動了克雷布斯迴圈。（它是糖酵解和檸檬酸迴圈之間聯絡的不可逆反應。）從丙酮酸合成乙醯輔酶 A 的機制需要五個輔酶和三種酶。這是一個非常複雜的機制，其中許多酶和輔酶。作為底物起作用的輔因子分為兩種不同的輔因子：催化輔因子和化學計量輔因子。催化輔因子包括輔酶，如硫胺素焦磷酸 (TPP)、硫辛酸和 FAD。化學計量輔因子包括輔酶，如 CoA 和 NAD+。丙酮酸透過三個不同的步驟轉化為乙醯 CoA，包括：脫羧、氧化和將所得的乙醯基轉移到 CoA。
丙酮酸透過三步反應形成乙醯-CoA
1. 脫羧：TPP 與丙酮酸結合並脫羧以產生羥乙基-TPP。在丙酮酸脫氫酶成分中，TPP 被稱為輔基，其中噻唑環中氮和硫原子之間的碳原子比大多數雙鍵碳基團的酸性更強，其 pKa 值接近 10。此反應由多酶複合物的 (E1) 丙酮酸脫氫酶成分催化。位於 TPP 中的碳中心被電離以形成一個碳負離子，它被新增到丙酮酸的羰基。作為脫羧的一部分，TPP 的帶正電荷的環穩定了轉移到環上的負電荷。最後，質子化產生羥乙基-TPP。
Pyruvate + TPP( conenzyme thiamine pyrophosphate)+ 2 H+ --> Hydroxyehthyl-TPP + CO2
2. 氧化：為了形成乙醯基，與 TTP 相連的羥乙基被氧化。同時，羥乙基被轉移到硫辛醯胺，它是衍生自硫辛酸的，透過醯胺鍵與賴氨酸殘基的側鏈相連。這產生了能量豐富的硫酯鍵的形成。在這個反應中，硫辛醯胺的二硫鍵充當氧化劑，並被還原成二硫醇形式。此反應也由丙酮酸脫氫酶成分 (E1) 催化，併產生乙醯硫辛醯胺。
Hydroxyethyl-TPP + Lipoamide --> TPP + Acetyllipoamide
3. 乙醯 CoA 的形成：乙醯 CoA 的形成：在此步驟中，當乙醯基從乙醯硫辛醯胺轉移時，乙醯 CoA 形成。此反應由二氫硫辛醯胺轉乙醯酶 (E2) 催化。當乙醯基被轉移到 CoA 時，能量豐富的硫酯鍵被保留。因此，檸檬酸迴圈的燃料，乙醯 CoA 已從丙酮酸生成，用於使用。直到二氫硫辛醯胺被氧化成硫辛醯胺，丙酮酸脫氫酶複合物才能完成另一個催化迴圈。
CoA + Acetyllipoamide --> Acetyl CoA + Dihydrolipoamide
4. NADH 的形成：該反應的最後一步發生在二氫硫辛醯胺脫氫酶 (E3) 使硫辛醯胺的氧化形式再生時。兩個電子首先被轉移到酶的 FAD 輔基，然後被轉移到 NAD+。這種電子轉移過程非常不尋常，因為已知 FAD 從 NADH 中接收電子，而不是將電子轉移出去。在酶內，FAD 的電子轉移勢能因其化學環境而增加，使其能夠將電子轉移到 NAD+。黃素蛋白是與 FAD 或 FMN（也稱為黃素單核苷酸）緊密結合的蛋白質。
Dihydrolipoaminde + FAD --> Lipoamide + FADH2 + NAD+ --> FAD + NADH + H+
總反應
Pyruvate + CoA + NAD+ --> acetyl CoA + CO2 + NADH +H+
1. 迴圈的第一個反應是乙醯-CoA 與草醯乙酸縮合形成檸檬酸。在這個反應中，乙醯基與草醯乙酸的羰基相連。乙醯-CoA 與草醯乙酸之間的反應對於形成用於水解的活性位點封閉的檸檬醯 CoA 複合物是必要的，因為乙醯-CoA 與水解的活性位點是一個浪費的過程。
Oxaloacetate + Acteyl-CoA --> Citryl-CoA + H2O -->Citrate + CoA
2. 透過順烏頭酸形成異檸檬酸：酶，烏頭酸酶催化檸檬酸可逆轉化為異檸檬酸。這實際上是一個兩步機制，它交換了氫與羥基。首先，檸檬酸脫水以形成三羧酸順烏頭酸的中間形成。然後，透過使用相同的酶烏頭酸酶，異檸檬酸形成。烏頭酸酶是一種鐵硫蛋白，參與底物的脫水和再水化。
Citrate <-(forward rxn removes water)-> cis-Aconitate <-(forward react with water)-> Isocitrate
3. 用 NAD+ 氧化異檸檬酸為 α-酮戊二酸、CO2 和 NADH。異檸檬酸脫氫酶催化異檸檬酸氧化脫羧生成 α-酮戊二酸。Mg2+ 用於與草醯琥珀酸的羰基相互作用。α-酮戊二酸的形成速率決定了檸檬酸迴圈中總反應的速率。中間體草醯琥珀酸是一種非常不穩定的 β-酮酸。與中間體的反應
Isocitatrate + NAD+ --> Oxalosuccinate + NADH + H+ Oxalosuccinate + H+ --> CO2 + α-ketoglutarate
總反應
Isocitrate + NAD+ --> α-ketoglutarate +CO2 + NADH
4. 將 α-酮戊二酸氧化為琥珀醯-CoA 和 CO2。這是另一個氧化脫羧反應。α-酮戊二酸在 α-酮戊二酸脫氫酶複合物的作用下被轉化為琥珀醯-CoA 和 CO2。NAD+ 用作電子受體，CoA 用作琥珀醯基的載體。該反應實際上與丙酮酸脫氫酶反應相同。此步驟中參與了三種酶。這類似於丙酮酸脫氫酶複合物反應。
α-ketoglutarate+ CoA + NAD+ -(α-ketoglutarate dehydrogenase complex)-> succinyl-CoA + CO2A +NADH
5. 將琥珀醯-CoA 轉化為琥珀酸：琥珀醯-CoA 具有硫酯鍵。硫酯鍵保留了大量的能量 (ΔG° = -33.5 kJ mol -1。透過斷開硫酯鍵釋放能量。此步驟中使用的酶稱為琥珀醯-CoA 合成酶或琥珀酸硫激酶。鍵的斷裂與 GDP 磷酸化相耦合。
Succinyl CoA + Pi + GDP --> succinate + CoA + GTP
6. 將琥珀酸氧化為延胡索酸：從琥珀醯-CoA 形成的琥珀酸被琥珀酸脫氫酶氧化為延胡索酸。FAD（連線到組氨酸側鏈）透過從琥珀酸中去除兩個氫來充當電子受體。FADH2 將其電子傳遞給輔酶 Q，輔酶 Q 將被用於電子傳遞鏈。
His-FAD + succinate <--> His- FADH2 + fumarate
7. 將延胡索酸水化為蘋果酸：然後延胡索酸透過使用延胡索酸酶轉化為蘋果酸。這種酶具有高度立體特異性；它催化延胡索酸的順式雙鍵的水合。該反應透過新增 H+ 和 OH- 來製備 L-蘋果酸。
Fumarate + H2O --> L-Malate
8. 在最後一步中，蘋果酸 (C4) 在蘋果酸脫氫酶催化的氧化還原反應中被氧化為草醯乙酸 (C4)，而 NAD+ 被還原為 NADH。該反應非常正，ΔG° = +29.7 kJ mol -1。
Malate + NAD+ <--> oxaloacetate + NADH + H+
9. 然後，只要氧氣被轉運到細胞中，克雷布斯迴圈就會再次重新開始。
請注意，碳的數量從一開始的 4 和 2 的總和變為 6、6、5、4、4、4，然後又回到草醯乙酸 (C4)。總的來說，由丙酮酸脫氫酶複合物產生的兩個乙醯-CoA 分子產生了 6 個 NADH、2 個 FADH2 和 4 個 CO2。
由於已知丙酮酸脫氫酶複合物的全部複雜結構，因此可以構建原子模型，從而能夠從模型中瞭解其活性。複合物的中心是由轉乙醯酶組分 E2 形成的。轉乙醯酶包含八個催化三聚體，它們聚集在一起形成一個空心立方體。每個形成三聚體的三個亞基都具有三個主要結構域。氨基末端包含一個小的結構域，該結構域包含一個結合的靈活的硫辛醯胺輔因子，該輔因子連線到賴氨酸殘基。該結構域與生物素結合結構域（如丙酮酸羧化酶）同源。硫辛醯胺結構域之後是一個小的結構域，該結構域與複合物中的 E3 相互作用，較大的轉乙醯酶結構域完成了 E2 亞基。E1 被認為是 α2β2 四聚體，而 E3 被認為是 αβ 二聚體。E2 被多個 E1 和 E3 的複製包圍。這三個不同的活性位點透過 E2 亞基的長而靈活的硫辛醯胺臂協同工作，該臂將底物從一個活性位點傳遞到另一個活性位點。硫辛醯胺在不同活性位點之間移動的過程是：
1）在 E1 的活性位點，丙酮酸脫羧並形成羥乙基-TPP 中間體，而 CO2 作為第一個產物離開。活性位點透過 E1 複合體內的長疏水通道連線到酶的表面。
2）E2 將硫辛醯胺臂插入到 E1 的深通道中，該通道通向活性位點。
3）E1 催化乙醯基轉移到硫辛醯胺。乙醯化的臂離開 E1 並進入 E2 立方體，以便訪問 E2 的活性位點。該活性位點位於立方體內部深處，靠近亞基介面。
4）然後將乙醯基轉移到 CoA。第二個產物（即乙醯輔酶 A）離開立方體。還原的硫辛醯胺臂然後擺動到 E3 黃素蛋白的活性位點。
5）在 E3 活性位點，硫辛醯胺被輔酶 FAD 氧化。重新活化的硫辛醯胺準備開始新的反應迴圈。
6）最終產物 NADH 是透過 FADH2 到 FAD 的重新氧化而產生的。
- 由於三種不同型別的酶的結構整合以及長而靈活的硫辛醯胺臂，這種複雜反應的協調催化成為可能。由於一種酶與另一種酶的接近，總體反應速率提高，副反應最小化。在整個反應序列中，丙酮酸氧化脫羧的所有中間體都保持與複合物結合。這很容易轉移到 E2 的靈活臂上，依次呼叫每個活性位點。
雖然可以透過丙酮酸形成葡萄糖，但丙酮酸轉化為乙醯輔酶 A 的不可逆步驟導致乙醯輔酶 A 無法轉化回葡萄糖。丙酮酸氧化脫羧生成乙醯輔酶 A 使葡萄糖的碳原子面臨兩種主要命運：透過檸檬酸迴圈被氧化成 CO2，同時產生能量，或者被整合到脂類中。丙酮酸脫氫酶複合物的活性受到嚴格控制。該反應可以被高濃度的反應產物抑制：透過直接結合，乙醯輔酶 A 抑制轉乙醯酶組分 E2，而 NADH 抑制二氫硫辛醯胺脫氫酶 E3。高濃度的 NADH 和乙醯輔酶 A 通知酶，細胞的能量需求已經滿足，或者為了產生乙醯輔酶 A 和 NADH，脂肪酸正在被降解，因為大多數丙酮酸是由糖酵解產生的葡萄糖衍生而來的。共價修飾在調節真核生物中的複合物方面非常重要。丙酮酸脫氫酶組分 (E1) 被丙酮酸脫氫酶激酶 I (PDK) 磷酸化關閉了複合物的活性。丙酮酸脫氫酶磷酸酶逆轉了這種失活。
在動物細胞中，檸檬酸迴圈的速率受到調節，以適應對 ATP 的需求。迴圈中進行變構調節的兩種酶是異檸檬酸脫氫酶和 α-酮戊二酸脫氫酶，它們都在迴圈中產生高能電子。
異檸檬酸脫氫酶被 ADP 刺激，ADP 增加了酶對底物的親和力。由於異檸檬酸、NAD+、Mg+ 和 ADP 是協同的，因此這些底物的結合受到調節。如果不需要能量，將會有更多 NADH 和 ATP，它們將分別與 NAD+ 和 ADP 競爭酶的結合。由於反應需要正能量或電子受體，反應會減緩，直到需要像 ATP 和 NADH 這樣的高能物質。
α-酮戊二酸脫氫酶是另一個變構酶，它調節檸檬酸迴圈的速率以適應 ATP 的需求。該酶被琥珀醯輔酶 A 和 NADH 抑制，它們也是產物，它們也與反應物競爭結合。α-酮戊二酸也被高能電子抑制。