結構生物化學/環境中重組DNA的測定方法

A. 導言

重組DNA技術的最大貢獻之一是能夠操縱微生物的DNA。這種也被稱為重組DNA (rDNA) 技術的DNA操作涉及將來自不同生物體的DNA片段插入不同的宿主（rDNA宿主）中。這通常透過使用載體來實現，載體允許DNA在宿主細胞中複製，從而產生新的操縱的微生物。因此，操縱微生物的做法一直是數百家公司、實驗室，甚至政府機構的研究重點。DNA微生物操縱成為如此熱門的研究主題的原因在於其在經濟層面的潛在效益。操縱的微生物的潛在用途包括：作為降解環境汙染物、殺蟲劑的生物體、為農作物提供保護、在醫學領域等。然而，轉基因微生物（GEM）的釋放一直是一個備受爭議的話題。人們擔心的是，將基因改造的微生物新增到環境中會帶來什麼樣的影響。主要的擔憂有兩個方面：1. 宿主細胞可能含有最初未知的致病基因，對所有生物體構成威脅。2. 改造後的生物體可能對生態系統產生影響，尤其是在進化方面，使某種生物體相對於其他生物體具有優勢，從而可能改變諸如營養迴圈、能量流動和生態系統等因素。這就是為什麼必須對將轉基因微生物（GEM）新增到環境中進行仔細研究和監管。因此，田納西大學的三位研究人員開展了研究，以確定環境中的基因改造微生物。

B. rDNA環境監測的要求

為了使用一種技術方法來觀察和尋找環境中的基因改造微生物，首先必須提出一系列問題，以確定該方法是否有效和/或是否為一種現實的技術。

1. 它應該適用於各種環境條件。2. 它在技術應用方面應該簡單易行。3. 它應該能夠檢測、識別和計數GEM。4. 它應該具有靈敏度和特異性，能夠檢測到少量種群。5. 它應該能夠將特定的GEM與環境中的其他生物體區分開來。6. 它應該能夠將GEM與同一物種的其他菌株區分開來。7. 它應該高效、經濟且省時。

這些方法反映了田納西大學的三位科學家所確定的規則。

C. 常規方法

I. 選擇性培養和富集技術

微生物選擇性培養的過程涉及選擇性培養基的存在。選擇性培養基可以根據物理生長條件（溫度、氧氣濃度）或成分進行區分。在檢測微生物的rDNA方面，培養只選擇rDNA宿主，而不是特定的rDNA序列。使用複雜培養基來適應rDNA宿主的複雜性，從而能夠區分非重組菌株。此外，這種技術只被認為是一種初步技術，因為它必須被認為是推定的，需要確認rDNA的存在。

II. 最可能數 (MPN) 方法計數

在這種方法中，首先將樣品稀釋至滅絕，然後使活細胞在適當的培養基試管中生長。然後，進行機率理論來確定種群的原始密度。使用的培養基決定了選擇或富集以及物種的生長和活性，因此它是另一種區分方法。然而，這種方法也有一些缺點，包括為了提高精確度，需要使用大量稀釋液和試管。

III. 熒光顯微計數技術

該技術涉及將細菌濃縮到膜過濾器上，然後對細菌進行染色，然後透過顯微鏡計數細菌。由於該技術缺乏其他常規技術的特異性，因此目前不再廣泛應用於GEM檢測。

常規方法的弱點

1. 弱點是該技術缺乏特異性。2. 該技術需要目標生物體的生長，因此如果生物體在取樣時受到壓力，則會低估或產生假陰性結果。3. 沒有通用的培養基能夠使樣品中所有潛在的宿主生物體生長。

D. 開發中的方法

I. 免疫技術 - 該技術涉及使用抗體（多克隆和單克隆抗體）來識別GEM，提供一種靈敏且特異的技術。

II. 酶聯免疫吸附測定 (ELISA) - 這種生化技術涉及使用特定的抗體來尋找特定的抗原，反之亦然，即使用特定的抗原來檢測特定的抗體。該過程靈敏且特異，這可能反映了其在定位GEM（基因改造微生物）方面的價值。

III. 放射性標記 - 該技術涉及一些放射性物質的偶聯，這使得轉基因微生物能夠被放射性標記。然而，主要缺點是成本高，需要大量的放射性物質。

IV. 熒游標記 - 該技術還涉及使用與熒光染料偶聯的抗體。將抗體新增到感興趣的樣品中，因此可以透過熒光顯微鏡觀察。

V. 使用質粒流行病學和限制性片段長度多型性 (DNA指紋圖譜) - 該技術是一種透過專門研究微生物的質粒來研究特定轉基因微生物的方法。透過瓊脂糖凝膠電泳分離質粒，並透過溴化乙錠染色凝膠，在紫外光下觀察。

VI. 使用可選擇的基因型標記 - 可以使用兩種不同的標記來研究GEM

1. 顯色標記

2. 抗體或抗性標記 - 許多這些標記存在於質粒或轉座子中，可以整合到細菌染色體中。

這些標記可以放置在微生物的質粒或染色體上。

VII. 使用核酸序列分析

VIII. 核酸雜交技術

IX. DNA：DNA菌落雜交

X. 南方印跡雜交

XI. 核酸與DNA提取物的雜交

XII. DNA：RNA雜交

XIII. 使用生物素化探針

參考文獻 Burlage R, Jain R, Sayler G. "環境中重組DNA測定方法." 生物技術評論, 8:1-33-84.