結構生物化學/核酸/含氮鹼基/核糖核苷酸還原酶

核糖核苷酸還原酶（或 RNR）是一種催化核糖核苷酸還原為脫氧核糖核苷酸的酶。這些脫氧核糖核苷酸隨後可以被細胞用於 DNA 複製。此外，由於 RNR 在脫氧核糖核苷酸的形成中所起的作用，RNR 負責調節細胞內 DNA 合成的速率。

RNR 類別

1. I 類：I 類 RNR 包含兩個亞組（Ia、Ib 和 Ic），它們在一級結構上略有不同；然而，這兩個亞組在含有兩個不同的二聚體亞基（R1 和 R2）以及需要氧氣才能形成穩定的自由基方面是通用的。Ic 類 RNR 是最近發現的，首次在沙眼衣原體中發現。證據還表明它存在於古細菌和真細菌中。Ic 類 RNR 的序列表明，三個亞組之間 PCET 通路和核苷酸還原酶活性位點的殘基是相似的。
2. II 類：II 類 RNR 在腺苷鈷胺素的幫助下形成硫醇自由基——腺苷鈷胺素充當 R2 亞基作為自由基生成器的作用——並利用硫氧還蛋白或谷胱甘肽還原酶作為電子受體。因此，II 類 RNR 僅由一個亞基組成，並以單體或二聚體的形式存在，既不需要氧氣，也不受氧氣的抑制。
3. III 類：III 類 RNR 與 I 類 RNR 一樣，由兩個二聚體蛋白亞基（NrdG 和 NrdD）組成；然而，與 I 類 RNR 持續需要 R2 來產生自由基不同，小的 NrdG 只在 NrdD 啟用期間需要。III 類 RNR 的機制使用甲酸作為電子受體，併產生對氧氣敏感的甘氨醯自由基，從而使酶在氧氣存在的情況下失活。

RNR 的自由基機制

儘管結構和電子受體存在差異，但所有三類 RNR 都是透過自由基機制進行的。 最終，RNR 催化一個反應，導致核糖的 2'-羥基被氫原子取代，從而產生脫氧核糖部分。

I 類 RNR 中的金屬輔因子組裝

儘管 I 類 RNR（Ia、Ib 和 Ic）具有相似的結構和途徑，但 RNR 催化核苷酸轉化為脫氧核苷酸的活性所必需的金屬輔因子卻存在顯著差異。這些輔因子的產生機制，無論是在體外還是在體內，以及檢查受損輔因子的修復方式，都表明了每個亞組對不同輔因子的依賴性。對這些金屬輔因子的途徑和啟用的研究有助於我們瞭解生物學如何防止金屬錯配的發生，並以高產率配置簇形成。所有三種 I 類 RNR 共享一種常見的催化機制，其中金屬輔因子直接或間接參與α的保守半胱氨酸氧化為硫醇自由基 S•)。I 類 RNR 氧化是透過 Ia 和 Ib 中的 Y• 發生的。

1. Ia 類：Ia 類 RNR 需要 FeIIIFeIII-Y• 輔因子。它位於 β2，位於疏水通道的末端，該通道是 O2 簇組裝的假定通路。在大腸桿菌研究中，體內過程表明，將大腸桿菌的 apo-β2 與 FeII、O2 和還原劑一起孵育，導致 FeIIIFeIII-Y• 輔因子的自組裝。此過程至少需要一種小的蛋白質或分子來將 FeII 遞送至 apo-β2，並遞送將 O2 還原為 H2O 所需的額外還原當量。這也可能是合理的，因為 Ia RNRN 比 FeII 更緊密地結合 MnII，因此需要某種伴侶蛋白來確保正確的金屬化。
2. Ib 類：Ib 類 RNR 對 FeIIIFeIII-Y• 和 MnIIIMnIII-Y• 輔因子都有活性。該酶可以在體外形成活性 FeIIIFeIII-Y• 輔因子，但只有 MnIIIMnIII-Y• 輔因子被發現與體內相關。這種形成的機制被認為是透過一種稱為 NrdI 的黃素蛋白氧化 MnIIMnII 中心而發生的，NrdI 是一種透過 O2 還原而產生的氧化劑。在大腸桿菌中，研究發現，當細胞中的鐵含量過低時，錳輔因子會被誘導，這表明錳在這種和其他生物體中的重要性。還應考慮一定程度的生物體依賴性金屬穩態變化，這可能有助於解釋為什麼一些生物體更頻繁地依賴於任何一種輔因子。
3. Ic 類：Ic 類 RNR 由於其假定的雙金屬輔因子 MnIVFeIII 而不同於 Ia 類和 Ib 類 RNR。Ic 類 RNR 在其金屬簇中儲存一個電子氧化當量。Ic 的體外自組裝類似於 Ia 和 Ib，它與 O2 和還原劑反應形成其各自的 MnIVFeIII 輔因子；然而，它與 2 當量的 H2 O2 反應形成活性輔因子也有所不同。Ic 類 RNR 已從其天然生物體中分離出來，這使其組裝複雜化，因為兩種不同的金屬對蛋白質具有相似的親和力。在沙眼衣原體的體外研究表明，調節金屬的水平以及新增順序是必要的。

在 I 類 RNR 的三個亞基中存在金屬載入正確的問題。在 Ia 類 RNR 中，它需要 FeIIIFeIII-Y• 輔因子，但該蛋白質比 FeII 更緊密地結合 MnII。在大腸桿菌中，NrdB 的正確金屬化依賴於遊離 MnII 和 FeII 的存在，同時鐵伴侶蛋白也存在以克服對 MnII 的結合偏好。Ib 類 RNR 中的問題是，它可能與 FeIIIFeIII-Y• 和 MnIIIMnIII-Y• 輔因子結合，但只有錳輔因子被發現與體內相關。Ib 結合取決於各個生物體的偏好以及它們固有的每種金屬的濃度。Ic 類 RNR 使金屬輔因子組裝複雜化，因為它需要兩種不同的金屬，它們對同一種蛋白質具有相似的親和力。調節兩種金屬的水平對於防止金屬錯配至關重要，其成功取決於兩種金屬的存在。在沙眼衣原體中，MnII 的缺乏或低於所需速率可能會導致二鐵簇的形成。因此，如果這些水平沒有得到調節，就會出現低活性、金屬化不當，最終影響 DNA 合成。一般來說，如果 I 類 RNR 中任何必需金屬的水平調節存在問題，就會導致低活性和金屬化不當，最終影響 DNA 合成。

I 類 RNR 中的金屬輔因子生物合成和修復

在研究不同金屬和複雜程度的金屬輔因子形成時，存在一些普遍的原則和挑戰，總結如下。在金屬酶研究中，需要考慮生理表達條件，以確認體外研究的蛋白質形式是否與體內活性形式相同。I 類 RNR 可以透過生物合成和修復途徑控制活性金屬輔因子的濃度。

1. 金屬蛋白的輔因子是由特定的生物合成途徑生成的。
2. 參與生物合成途徑的蛋白質通常與目標金屬蛋白的操作子相關聯，並且可以透過比較基因組序列來分析某些因素。
3. 為了促進配體和蛋白質因子的交換，金屬以其還原狀態轉移。
4. 存在多種蛋白質因子，包括：將金屬遞送至活性位點的金屬插入酶或伴侶蛋白，控制金屬氧化狀態的特定氧化還原蛋白，以及幫助摺疊和展開過程以使金屬能夠插入活性位點的 GTP 酶或 ATP 酶。
5. 由於影響途徑因子的生物冗餘，需要對多個基因進行缺失，以便在基因缺失實驗中識別表型。
6. 金屬向蛋白質的遞送及其調節的層次結構被推斷出來，但尚未完全瞭解。
7. 區室化（例如原核生物中的周質空間與胞質溶膠）和蛋白質對某些金屬的優先結合親和力是導致細胞水平上金屬錯配的兩個可能因素。
8. 一些蛋白質尚未從其天然來源中分離出來，並且形成了異源表達系統，導致金屬錯配。由於最佳活性水平尚不清楚，因此對應於低活性的不正確簇可能無法被識別。
9. 某些氧化劑會導致金屬簇的損傷（例如 NO 和 O2），並且在修復過程中使用特定的途徑。
10. 在氧化狀態發生變化期間，通常需要質子進行這種金屬氧化。金屬結合的配體可以輕鬆重組，羧酸鹽配體的重組對於簇組裝過程至關重要。

最大的難題之一是，特定蛋白質結合所需的金屬元素往往不是與之親和力最高的金屬元素。Irving-Williams 系列（MnII < FeII < CoII < NiII < CuII > ZnII）最能描述蛋白質對二價金屬的相對親和力，此外還取決於金屬結合發生的特定蛋白質配位環境。對於系列中後期的金屬，存在伴侶蛋白來幫助它們移動到活性位點，而細胞內它們可能以低濃度的“遊離”金屬形式存在。除了遞送之外，這些伴侶蛋白還有另一個功能，即幫助維持這些金屬的遊離濃度處於較低水平，以防止錯配金屬化和在需要 MnII 和 FeII 的其他蛋白質之間發生結合。細胞區室化可以克服蛋白質的結合偏好，因為某些活動發生在細胞的不同部位，這些部位具有並需要不同數量的金屬元素。在藍藻中，發現 MnII 依賴性的胞外蛋白必須在細胞質中摺疊，在細胞質中 MnII 的自由量高於 ZuII、CuI 和 CuII。

研究 RNR 活性的技術

實驗室中有一些技術用於監測 RNR 金屬輔因子的活性。這有助於透過研究這些輔因子的運動來確定準確的提議機制、產生和功能，這些機制是在體外和體內進行的。

1. 全細胞電子順磁共振：EPR 用於研究釀酒酵母中 FeIIIFeIII-Y• 的生物合成。發現 Y• 水平在各種生長條件下都足夠高，並且可以在內源水平上檢測到，這意味著 Y• 不會隨著細胞週期的變化而調節。需要一個小的分子或蛋白質因子來快速還原細胞裂解物中的 Y•，這表明存在一個金屬輔因子，後來被鑑定為鐵。
2. 穆斯堡爾譜：這種型別的譜學監測鐵從氧化和還原鐵庫到 RNR 輔因子的移動。它允許同時檢測鐵的所有氧化態，並且對存在於鐵物種周圍的電子環境敏感。為了使這種技術準確，細胞首先需要用 Fe57 同位素標記。