RNA 剪接

RNA 剪接是 RNA 在初級轉錄本轉錄為 mRNA 過程中發生的一種修飾。剪接指的是內含子的切除或去除，以及剩餘的序列（稱為外顯子）的連線。這種修飾發生在細胞核中，在 RNA 被轉移到細胞質之前。

剪接發生在生命的所有領域，但不同主要分支之間的剪接型別差異巨大。真核生物剪接許多編碼蛋白質的信使 RNA 和一些非編碼 RNA。另一方面，原核生物很少剪接，當它們剪接時，主要是非編碼 RNA。

RNA 剪接的發現

RNA 剪接是由兩位科學家菲利普·艾倫·夏普和理查德·J·羅伯茨發現的，他們因其成就獲得了 1993 年諾貝爾生理學或醫學獎。RNA 剪接的最初發現解決了一個早期的悖論，科學家們曾在細胞核中發現了比細胞質中發現的 mRNA 長得多的 RNA。奇怪的核 RNA 具有包含帽子結構的 5' 端和包含聚腺苷酸 [poly(A)] 軌跡的 3' 端，這些結構類似於在細胞質中發現的較短 mRNA 中發現的結構。隨後剪接的發現解釋了較小的 mRNA 如何具有與較長的核 RNA 相同的末端。雖然末端相同，但長度不同，因為內含子已從鏈的中部去除。這些內含子被發現證明是對細胞的一個問題，因為例如，幾乎四分之一導致 β 地中海貧血的血紅蛋白基因突變來自剪接問題。

透過開發複製 RNA 剪接的反應變得很明顯，剪接是由 lariat RNA 的分支狀部分完成的，並且這些 RNA 是剪接不可或缺的。後來發現這些小的 snRNA 彙集了剪接體中發現的顆粒。透過由 lariatRNA 和 5' 外顯子-RNA 組成的中間體，剪接體能夠去除內含子。

剪接體

在真核生物中，基因被轉錄為信使 RNA，其中包含內含子和外顯子。為了產生有效的 mRNA，內含子需要被剪除，而外顯子則需要透過剪接體（細胞的分子裁縫）重新連線在一起。剪接體能夠改變其剪下和縫合過程，以便根據單個 pre-mRNA 布料卷軸生成 mRNA 變異。可變剪接是剪接體可以從單個 pre-mRNA 布料中開發出多種 mRNA 異構體的方式。這種可變剪接在不增加基因數量的情況下，增強了複雜多細胞生物的進化可能性。

剪接體被認為是真核細胞中最複雜的巨型分子機器之一。它涉及數百種 RNA 和蛋白質機制，特別是組裝和拆卸途徑。剪接體在真核生物中的主要作用是產生信使 RNA。基因被轉錄為 mRNA 的前體，稱為 pre-mRNA，然後透過剪下和縫合內含子和外顯子成分來生成 RNA。內含子是 pre-mRNA 的區域，被剪接體切除以用作非編碼 RNA 的來源。外顯子編碼蛋白質，因此通常是需要的。此外，剪接體可以獨特地剪下和縫合，從而產生不同型別的 mRNA，這使得進化允許生物體增加基因數量和複雜性。剪接體被認為是細胞中最複雜的巨型分子機器之一的原因是，它們有責任正確識別和處理大量序列。例如，剪接體最終會處理芽殖酵母中的五種小 RNA 和多達 100 種不同的多肽。為了使事情變得更加複雜，人類甚至需要使用第二種剪接裝置，即次要剪接體。在研究這些複雜的機器時，由於體記憶體在的限制，許多障礙出現了。然而，研究剪接的新方法已經發展起來，例如體外組裝和純化活性剪接體、單一剪接體的顯微鏡視覺化等等。這些方法的優點是它們更具體，並允許研究數百或單個 RNA 分子的更廣泛範圍。一種新方法涉及使用微陣列。

使用依賴於剪接的微陣列允許研究人員區分剪接迴圈的哪些特徵是通用的，哪些是特定於 pre-mRNA 的。開發的 DNA 陣列組區分剪接和未剪接的 RNA，然後用細胞 RNA 探測以進一步分離。對剪接反應的分析使人們能夠觀察特定蛋白質活性喪失如何直接影響單個 pre-mRNA 的剪接。總的來說，微陣列透過有效地分離所需的蛋白質，證明了其在 pre-mRNA 識別方面的重要性。

剪接體分析經常會遇到重大障礙，難以深入瞭解更詳細的機制。為了克服這些困難，實驗室技術採用了體外方法，包括觀察單個 pre-mRNA 分子，以及活性剪接體純化，包括經過良好表徵的酶和受控條件。儘管每種化學方法都相對獨特，但每種方法都貢獻了互補的協同觀點，增強了對剪接機制的瞭解。

剪接體是一個複雜的巨型分子機器，由小核糖核蛋白顆粒 (snRNP) 組成：U1、U2、U4、U5 和 U6，以及大約 100 種不同的剪接因子。snRNA 的長度在 107-210 個核苷酸之間；snRNA 與蛋白質連線形成小核糖核蛋白顆粒 (snRNP)。snRNP 包含一個單一的 snRNA 和多個蛋白質。

剪接是在多兆道爾頓複合物中進行的。這意味著剪接體是由多個元件以有序的方式組成的。首先，U1 snRNP 結合到 5' 剪接位點 (SS)。同時，分支點橋接蛋白 (BBP) 和 Mud 2 結合到分支點。然後，U2 snRNP 將取代 BBP/Mud 2 並結合到分支點。接下來，U4/U6.U5 三 snRNP 也將結合到該複合物中。在剪接 RNA 之前，U1 和 U4 將離開該複合物，Prp19 將結合。剪接完成後，剪接體將發生構象變化以進行連線過程。連線過程完成後，剪接體的成分將降解並被回收利用。因此，每個剪接體都是一種單次週轉酶。

從所有新開發的技術來看，可以確定體內剪接體迴圈遠非簡單，而是一個“非凡的動態和靈活的機器”。新技術不斷地帶來關於 pre-mRNA 底物的詳細可逆、不可逆、動力學和機制相互作用的新證據。關於剪接體及其過程，仍然有很多未知之處。仍然缺乏結構資訊，這意味著許多功能細節不可用。動力學理解也未知。然而，對這種動態機器的研究仍在發展，並不斷髮現關於其目的的新方法和資訊。

pre-mRNA 剪接過程

剪接需要內含子中存在三個序列。內含子的一端是 5' 剪接位點，另一端是 3' 剪接位點。在這些位點是短的共有序列。外顯子在 mRNA 中的排列順序通常與相應 DNA 中的序列相對應。該過程由剪接體輔助，剪接體是小的 RNA 分子，識別內含子的開頭（通常是 GU）和結尾（通常是 AG），並在這些位點催化剪接。在這些位點改變單個核苷酸可能會阻止剪接發生。也存在自剪接內含子。對剪接很重要的第三個序列位於分支點。分支點是腺嘌呤核苷酸位於 3' 剪接位點之前 18 到 40 個核苷酸的位置。分支點處腺嘌呤核苷酸的缺失或突變會阻止剪接。剪接發生在稱為剪接體的大的結構中。

在剪接發生之前，外顯子 1 和外顯子 2 之間存在一個內含子。前體 mRNA 透過兩個步驟進行剪接。第一步，前體 mRNA 在 5' 剪接位點被剪接，將外顯子 1 與內含子分離。然後，內含子的 5' 端連線到分支點，向自身摺疊，形成一個稱為套索的結構。摺疊透過 5' 共同序列中的鳥嘌呤核苷酸與分支點處的腺嘌呤核苷酸透過轉酯化反應結合而發生。第二步，在 3' 剪接位點進行剪接，外顯子 1 的 3' 端連線到外顯子 2 的 5' 端。內含子以套索的形式分離，並在分支點處的鍵斷裂後變為線性，然後被核酶降解。最後，僅由拼接在一起的外顯子組成的成熟 mRNA 被轉移到細胞質中進行翻譯。

需要注意的是，5' 帽子極大地影響前體 mRNA 加工和 mRNA 匯出，如果它被去除，則被稱為 mRNA 降解中的第一個不可逆步驟，這將影響整個基因表達。

Splice sites of mRNA precursors — mRNA 前體的剪接位點

前體 mRNA 剪接：組成型 vs 選擇性

組成型剪接是指 mRNA 以完全相同的方式剪接，每次都使用剪接體。

選擇性剪接允許透過 SR 蛋白對基因進行不同的表達，SR 蛋白選擇剪接的替代位點，使用不同的外顯子或以不同的順序表達它們。透過選擇替代剪接位點的組合，可以建立結構和功能上不同的蛋白質異構體。據估計，至少 75% 的人類基因經歷了這種機制。

另一種選擇性剪接使用多個 3' 裂解位點。前體 mRNA 序列中存在 2 個或更多個潛在的裂解位點。但是，這可能或可能不會產生不同的蛋白質。

選擇性剪接可以在細胞壓力下發生

由於選擇性剪接可以控制基因表達，因此它是細胞在應對某些壓力環境和病理細胞狀況（如熱、冷、紫外線、氧氣、離子平衡、感染、炎症、發燒等）時可以利用的重要機制。

剪接因子可以增強（識別正向序列元件）或沉默（識別負向序列元件）。這些序列元件可以是外顯子或內含子，這決定了它們是包含（外顯子）還是排除（內含子）。剪接增強子通常由 SR 蛋白結合並激活。SR 蛋白是“富含絲氨酸/精氨酸”的蛋白質；它們是一組在進化過程中高度保守的蛋白質，參與選擇性和組成型剪接。它們參與調節和選擇剪接位點。

示例

選擇性或非常規的 mRNA 剪接可以作為某些細胞器（如內質網 (ER)）的適應性應激反應的一部分。此外，異常的 mRNA 剪接也可能與細胞凋亡有關。在壓力條件下，未摺疊的蛋白質在 ER 中積累並形成聚集體。這些異常聚集體會引發稱為未摺疊蛋白質反應 (UPR) 的反應過程，該過程由存在於 ER 中的幾個不同的壓力感測器觸發。其中一個感測器是肌醇依賴性酶 1α (IRE1α)，一種 I 型跨膜蛋白，一旦被啟用，就會啟動編碼轉錄因子 X 盒結合蛋白 1 (XBP1) 的 mRNA 的異常剪接，導致翻譯更穩定的剪接形式的 XBP1 (XBP1s)。XBP1s 易位到細胞核，在那裡它控制與蛋白質摺疊、質量控制、ERAD 和 ER/高爾基體生物合成相關的 UPR 相關基因子集的上調。此外，ER 長時間應激會導致 IRE1α 訊號傳導失活，這反過來又與 XBP1 mRNA 剪接的減弱相關，該過程可能使細胞對凋亡敏感。

在熱休克蛋白 47 (HSP47) 中，前體 mRNA 非編碼區 5' 剪接位點的選擇效率更高。在冷休克中，神經纖維瘤病 1 型 (NF1) 中誘導了選擇性前體 mRNA 剪接，從而帶來了一個隱蔽的外顯子。壓力誘導的長期神經元超敏反應與壓力誘導的神經元乙醯膽鹼酯酶 (ACHE) 前體 mRNA 的選擇性剪接有關。

熱休克應激的影響

許多型別的壓力，包括熱休克，可以立即阻止許多重要的代謝過程，例如 DNA 複製，直到恢復。熱休克蛋白 (HSP) 有助於保護細胞免受損傷，並幫助細胞恢復，並在熱休克條件消退後。熱休克蛋白中前體 mRNA 剪接的阻斷是特徵明確的。然而，HSP 的表達不受影響，因為它們不包含任何內含子。

SRp38 是一種 SR 蛋白，當過表達時，它會拮抗 SR 蛋白 SF2/ASF（剪接因子 2/選擇性剪接因子）的活性。SRp38 的獨特之處在於，當被磷酸化時，它會啟用需要一個尚未確定的輔助因子的序列特異性剪接。這種活性源於 SRp38 進入與 U1 和前體 mRNA 的複合物，這加強了 U1 和 U2 與前體 mRNA 的相互作用。SRp38 在熱休克後去磷酸化後是一個強大的剪接抑制劑；在輕度熱休克後，它會被重新磷酸化，伴隨著剪接活性的恢復。

核應激體 (nSB) 被認為透過將一組剪接因子帶到它們與 SATIII 轉錄本結合的區域來控制壓力下的剪接活性。nSB 是人類細胞中熱休克因子 1 (HSF1) 積累的位點，在輕度熱休克、化學和高滲應激後短暫出現。它們也是前體 mRNA 剪接因子（SF2/ASF、9G8、SRp30c 用於腺病毒 E1A 基因）積累的位點。nSB 組裝在由長衛星 III (SatIII) DNA 組成的染色質區域上。熱休克後，染色質重組與 HSF1 轉錄 SatIII RNA 同時發生。SF2/ASF 和 SRp30c 蛋白的募集需要應激誘導的 SATIII 轉錄本。減少轉錄會阻斷 SR 蛋白剪接因子的募集。

RNA 剪接的結構洞察

對內含子和選擇性剪接的研究導致了對真核生物和原核生物中內含子的額外分類。已經發現了兩組內含子。第一組內含子，I 類內含子，是第一個被發現的自我剪接核酶。II 類內含子後來被報道。II 類內含子具有高度複雜的 RNA 結構，並且它們還具有獨特的多種化學反應活性。II 類內含子具有催化 2'-5' 鍵形成的能力，以及逆轉錄到 DNA 的能力。逆轉錄到 DNA 需要內含子編碼蛋白的幫助。對 II 類內含子的二級結構的具體分析揭示了六個結構域。域 V 在系統發育上最為保守（在各種生物群體中密切相關）。域 V 的下部螺旋具有一種催化三聯體，它由與稱為 U6 剪接體 RNA 的剪接體非常相似的核苷酸組成。這導致人們相信 II 類內含子與核內含子和真核剪接體具有共同的祖先。這導致了對 II 類內含子的進一步細緻研究。

II 類內含子的研究

II 類內含子根據其 RNA 二級結構被進一步分類為三個主要的結構元素。這三組是 IIA、IIB 和 IIC。逆轉錄酶分析表明，IIC 類內含子是 II 類內含子中最原始和最簡單的譜系。IIC 譜系的二級結構比 IIA 和 IIB 的簡單得多。由於 IIC 類內含子更小且更簡單，因此它們更受結晶研究的青睞。海洋桿菌 (Oceanobacillus iheyensis) 是第一個成功結晶其 II 類內含子並透過 X 射線衍射進行檢查的生物體。IIC 類內含子與 IIA 類和 IIB 類內含子的顯著區別在於，剪接第一步中使用的親核試劑是一個水分子。IIA 類和 IIB 類內含子使用來自域 VI 中腺苷的 2'-OH 親核試劑。由於 IIC 類內含子使用水分子，因此釋放的內含子是線性分子，而 IIA 類和 IIB 類內含子將以套索分支的形式釋放。IIC 類內含子的使用進一步表明活性位點由上面提到的域 V 的凸起和催化三聯體組成。已經證明，這些區域受到催化金屬離子（即鎂）結合的影響。這種金屬離子相互作用在蛋白質中非常常見，以便影響形狀，即 Fe 血紅蛋白。離子有助於調節內含子或蛋白質核心處的靜電環境。金屬離子相互作用還可以形成或破壞 DNA 和 RNA 聚合酶中的磷酸二酯鍵。

可能的剪接錯誤

雖然剪接錯誤的發生率很低，但由於多種可能性，偶爾也會發生。剪接錯誤最有可能導致剪接位點發生突變，並可能導致該位點功能喪失。過早終止密碼子的暴露，外顯子或內含子的錯位/錯插入，都可能導致突變。剪接位置變化引起的突變可能導致錯誤的氨基酸被解讀。錯誤解讀的氨基酸可能導致特異性降低。所有突變都可能導致蛋白質構建錯誤，這可能是危及生命的，例如鐮狀細胞性貧血或囊性纖維化。幸運的是，許多剪接錯誤可以透過無義介導的 mRNA 降解機制得到保護。

無義介導的 mRNA 降解

無義介導的 mRNA 降解是細胞中的一種 mRNA 機制，用於檢測錯誤剪接的資訊，並防止錯誤蛋白質的表達。轉錄後，mRNA 會與核糖核蛋白重新組裝。無義介導的 mRNA 降解是由外顯子連線複合體啟動的，這些複合體在 mRNA 加工過程中被剪切出來。位於無義密碼子之後的 exon 連線複合體充當 mRNA 核糖核蛋白 (RNP) 的標籤。RNP 能夠識別這些本應被剪下掉的外顯子的存在所引起的混亂和錯誤剪接。無義介導的 mRNA 降解會將帶有 exon 標籤的錯誤資訊從細胞核轉運到細胞質，在那裡錯誤資訊 RNA 被降解。

參考文獻

Cellular stress and RNA splicing. Biamonti G, Caceres JF. Trends Biochem Sci. 2009 Mar;34(3):146-53. Epub 2009 Feb 7.

William Fontaigne De La Tour Dautrieve

Aaron A. Hoskins, Melissa J. Moore, The spliceosome: A Flexible, Reversible Macromolecular Machine, Trends in Biochemical Sciences, Volume 37, Issue 5, May 2012. <http://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S0968000412000345>

Sharp, Phillip A. "The Discovery of Split Genes and RNA Splicing." Trends in Biochemical Sciences 30.6 (2005): 279-81.

Woehlbier, U., Hetz, C. Modulating stress responses by the UPRosome: A matter of life and death. Trends in Biochemical Sciences, June 2011, Vol. 36, No. 6.