結構生物化學/核酸/RNA/短RNA測序

引言

短RNA包括不同類別的分子，如小核RNA、微RNA和轉移RNA等。許多功能性RNA由於在基因序列的啟動子和3'末端發現了短RNA，因此被較少地表徵為短RNA。它還涉及引數突變，是基因座上兩個等位基因之間的相互作用，導致另一個等位基因發生分子間變化。短RNA可以在研究領域中進行研究，以描述和分析開發具有單分子測序（SMS）的短RNA物種的策略和過程，以及其在許多實驗室研究中的效率。短RNA來源於細胞中功能性前體RNA物種的最終產物。細胞中短RNA物種的一個例子可以在DNA序列中的基因剪接和3'端RNA加工中找到，用於合成生長較長的mRNA。然而，許多與非蛋白質編碼功能性RNA相關的類別很可能來自比生長較長的mRNA更長的前體。為了將RNA分餾成物種，一些方法被用於研究短RNA的各種功能。例如，Philipp Kapranov博士及其研究人員使用Helicos單分子測序方法來研究細胞中短RNA的細節。

短RNA的RNA分離

為了進行RNA的分離，使用mirVana miRNA分離試劑盒和miRNeasy Mini試劑盒（也稱為Qiagen）從總RNA（培養細胞）中純化sRNA。RNA試劑盒用於大量sRNA（來自培養細胞）的製備。透過這種RNA/DNA試劑盒方法，特定組分的sRNA透過TBE-尿素聚丙烯醯胺凝膠的洗脫和電泳方法進行純化。電泳是由於整個細胞結構中空間均勻的電場導致流體中粒子擴散的作用。

分析短RNA的困難

在科學家和研究人員中，研究短RNA極具挑戰性。一些難題挑戰著研究短RNA的研究人員：1）必須成功分離出具有所需長度範圍的特定sRNA。2）對具有分子手柄（如用於自身轉化為cDNA的mRNA的3'PolyA尾）的sRNA缺乏興趣。3）sRNA有時太短，無法有效且成功地用六聚體轉化為cDNA。4）一些特定的sRNA在其5'和3'末端的基因序列上具有修飾，這些修飾會干擾隨後的分子操作的讀取；因此，一些sRNA經常無法被許多研究人員使用的方法檢測到。5）某些sRNA具有牢固的2'結構，阻止自身被研究人員在非變性條件下經常進行的酶促方法檢測到。6）某些sRNA（如miRNA）長度很短，無法有效地用於複雜基因組的對映；因此，發現sRNA及其特定功能對於研究人員來說非常具有挑戰性，他們需要研究和進行與sRNA相關的實驗。7）許多方法依賴於使用連線過程和PCR擴增，這可能會錯誤地表示細胞結構中RNA物種的組成和定量。此外，8）sRNA組分可能主要由snRNA、rRNA和sno RNA等RNA類別高度存在（這將需要大量的複雜性才能完成細胞中sRNA群體的表徵。研究sRNA最具挑戰性的部分恰好是處理細胞中的物理結構：sRNA的短長度使研究人員難以進行實驗。

sRNA組分的分離

使用多種方法，可以使用miRNeasy或DNA/RNA試劑盒（Qiagen）檢測和分離sRNA組分。如果需要，可以透過使用TBE-尿素變性聚丙烯醯胺凝膠電泳作為研究sRNA的科學家和研究人員的另一種替代方法，在特定尺寸範圍內進行sRNA分離。研究sRNA的一種方法是使用3'PolyC對RNA進行尾部修飾：將RNA與水混合在PCR擴增管中，並將其與方案一起使用；然後，將sRNA在PCR儀中於85攝氏度孵育2分鐘，並在冰上至少孵育2分鐘。孵育後，向溶液中加入大腸桿菌Poly A聚合酶緩衝液並混合。用苯酚或氯仿或異戊醇重複提取sRNA兩次，持續幾秒鐘；然後，加入100% EtOH（乙醇）純化半小時，溫度為零下80攝氏度。在4攝氏度下離心30分鐘。然後，用70% EtOH洗滌，最後用水中復溶。

cDNA序列的製備

cDNA可以透過末端轉移酶（TdT）方法在3'末端用poly-A聚合酶進行測序，並在另一個3'末端進行阻斷。因此，cDNA可以結合到存在於細胞表面的oligo-dT上。此方法是方案和poly A方案的常用方法。如果預期cDNA濃度在5-10 ng的特定範圍內，則使用常規NanoDrop在實驗下分析一些cDNA。cDNA的尾部修飾部分如下：1）製備cRNA以在水中進行尾部修飾，並且根據其體積，其孵育時間和緩衝液量會有所不同。孵育後，將一定量的TdT緩衝液新增到cDNA溶液中；將cDNA在PCR擴增儀中於37攝氏度孵育1小時。將孵育的cDNA樣品在95攝氏度加熱5分鐘。隨後，新增TdT緩衝液並重復孵育以獲得cDNA的最終序列，並測量樣品中尾部修飾的cDNA的濃度。

參考文獻

1. http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/22144202
2. http://en.wikipedia.org/wiki/Electrophoresis