結構生物化學/克服蛋白質晶體學的挑戰
因為膜蛋白仍然是結構生物學家最難的目標之一，因為所有細胞都有一個脂質雙層，蛋白質嵌入脂質雙層中，除了這些蛋白質，膜外通常還有結構域。這些蛋白質已被徹底研究，它們參與了呼吸、光合作用、訊號轉導和分子轉運等一系列過程。
在 20-30% 的蛋白質組中，只有少數膜蛋白的結構透過 X 射線晶體學或核磁共振解析出來。在蛋白質資料庫中，關於膜蛋白的 50,000 多個條目中，只有 1% 多一點的資訊與膜蛋白有關。這個膜蛋白資訊比例很小，可以得出結論，膜蛋白很難研究。由於膜蛋白具有疏水錶面，這種特性使得它們只能用去垢劑一起從細胞膜中提取出來。這些膜蛋白也常常非常靈活和不穩定，這是一個重要的挑戰，因為它在多個層面上（表達/溶解/結晶/資料收集/純化/結構解析）都很難解決。
有一些已知的膜蛋白結構，它們要麼是化學合成的（對於短肽），要麼是純化的（從天然來源），或者甚至重組產生的。例如，乳酸乳球菌、畢赤酵母、釀酒酵母和大腸桿菌都在昆蟲細胞和哺乳動物細胞系中表達過。更具體地說，大腸桿菌的生產非常快、廉價且易於使用篩選，因此這會影響表達系統的成功。但對於真核蛋白，必須使用不同的系統——需要真核系統才能表達。首先，膜蛋白只有在被宿主細胞膜靶向的情況下才能正確摺疊。其次，膜蛋白嵌入其中的脂質的性質和組成在不同的系統中會有所不同。因此，脂質性質對蛋白質穩定性的影響會影響結晶的可能性。第三，真核蛋白可能經歷糖基化和其他修飾（翻譯後）。39 種獨特的真核膜蛋白中有 17 種是使用重組方法產生的，而另外 9 種來自酵母系統；昆蟲細胞中還有 4 種，大腸桿菌中還有 4 種。
去垢劑在從宿主細胞膜中提取膜蛋白中起著重要作用，因為去垢劑能夠包圍蛋白質的疏水錶面，從而使溶解發生。由於這一關鍵步驟，為這一純化過程仔細選擇去垢劑也很重要。去垢劑經過多次測試，測試其提取最大量可溶、活性、穩定的蛋白質的能力。但也有一些去垢劑在從膜中提取蛋白質方面很有效，但這些去垢劑在保證溶解的膜蛋白方面效率不高，例如 FOS-膽鹼。因此，必須有滿足多種特性的去垢劑；十二烷基麥芽糖苷 (DDM) 是一種特殊的去垢劑，用於從脂質雙層中提取膜蛋白，它可以以相對便宜的價格以穩定方式提供溶解的膜蛋白。
在評估膜蛋白的表達和純化方法方面取得了許多進展。Jan-Wilem De Gier 教授和 Eric Gouaux 介紹了一種在純化過程中跟蹤蛋白質的技術，即利用在該蛋白質的 C 端融合的 His 標籤切割 GFP（綠色熒光蛋白）的能力。在大腸桿菌表達系統中，這種系統在目標膜蛋白具有胞質 C 端的條件下取得了成功；這是因為綠色熒光蛋白只有在胞質中才能發熒光，並且只有在胞質中才能正確摺疊。因此，透過在 S. Cerevisiae 和大腸桿菌中表達的原核和真核綠色熒光蛋白融合蛋白，顯示出用於大規模純化的最高表達產量。很多時候，GFP 融合蛋白可能不需要先前的純化，這可以透過凝膠熒光分析和熒光尺寸排阻色譜清楚地顯示出來。
另一種在篩選許多膜蛋白表達和溶解構建體和條件的技術得到了解釋，它最初是為進行小規模純化的蛋白質解釋的，更具體地說是對於 96 孔格式中的蛋白質。但從最初的解釋來看，它已經發生了改變，以便能夠識別菌落內的蛋白質表達；這種技術是透過菌落過濾印跡法在菌落被印到膜上後進行誘導表達，然後用各種測試去垢劑裂解細胞。一旦這些去垢劑溶解的蛋白質被過濾到整個膜中，它們就會被抗標籤抗體檢測到。找到膜蛋白更穩定的條件可能在結晶改善之前，但膜蛋白往往在去垢劑膠束中處於不穩定的狀態。通常會新增脂質以保持穩定的溶解樣品；凝膠過濾、電子顯微鏡或超速離心用於監測材料在篩選不同的緩衝液和去垢劑條件時的聚集狀態。熱穩定性也被研究作為監測蛋白質狀態的一種手段。許多研究透過分析與附著在可訪問的半胱氨酸殘基上的染料的共價鍵的熒光來進一步推進。此外，最近的研究還表明，使用點突變提高 β1-腎上腺素能受體的穩定性，並測試由此產生的突變體的活性。
蛋白質結晶過程透過對大量可能被利用的試劑進行多次測試來實現。但這些最初的結晶條件不足以確定它是否完全最佳，直到獲得良好衍射的晶體。在過去十年中，使用 100 nl 滴獲得了必要的常規晶體篩選，儘管已經為可溶性蛋白質提供了許多 96 孔稀疏矩陣篩選系統，但這些系統都包含許多特定特性，其中蛋白質不太可能結晶在其中。因此，巖田小組設計了專門設計的結晶篩選，這些篩選是為最佳化膜蛋白的蛋白質結晶而準備的。在大量證據之後，已經證明，在結晶過程中篩選去垢劑是一個重要的過程。透過在結晶液滴中新增存在的去垢劑，可以提高晶體質量。因此，蛋白質分子可以以有序的方式形成晶體，這是由於三維連續脂質相的能力；這些型別的相允許膜蛋白在脂質中自由擴散，而不是將膜蛋白封閉在去垢劑膠束中。
在可溶性蛋白質晶體上的資料收集現在已成為一種常規操作，晶體被放置在樣品更換器上，並自動收集資料。對於膜蛋白晶體來說，這種情況變得很困難，因為來自膜蛋白的晶體通常由於去垢劑膠束（去垢劑膠束會包圍蛋白質的疏水部分）而含有很高的溶劑含量。因此，這些晶體由於其脆性且晶體質量很低而難以處理。這種型別的資料收集會導致需要篩選大量晶體。但由於同步輻射光束線具有自動樣品更換功能，上述情況已得到解決，並能夠高效快速地篩選許多晶體。從這些光束線上收集資料集，這些光束線從小的晶體中收集資料集，同時還從良好衍射區域收集資料。資料集還從晶體長度收集，即使有單個部分受到輻射損傷。由於膜蛋白的高溶劑含量，相位的巨大改進導致了溶劑平滑。
有大量證據表明，與可溶性蛋白質相比，膜蛋白的結構解析仍然存在許多特定挑戰。但為了設計能夠結晶的蛋白質並使這些蛋白質穩定，已經取得了各種進展。據推測，在未來幾年，膜蛋白結構的數量將迅速增長，特別是真核膜蛋白。這些發現不僅有助於我們瞭解蛋白質在膜中的摺疊和功能，而且還將提供大量關於未來新型藥物潛在設計的資訊。