結構生物化學/磷脂醯絲氨酸結合基序和PKC

PKC受二醯基甘油和氨基磷脂磷脂醯絲氨酸的控制。磷脂醯絲氨酸特異性的分子基礎被認為是由於存在一個假定的磷脂醯絲氨酸結合基序，該基序位於PKC的C2結構域中。為了確定該基序是否介導PKC與磷脂醯絲氨酸的相互作用，PKC BII中羧基末端的鹼性殘基被突變為丙氨酸。此外，還觀察了磷脂醯絲氨酸對突變酶的調控。

膜結合和活性測量表明，突變蛋白的磷脂醯絲氨酸調控與野生型蛋白激酶C沒有區別。無論是在有或沒有二醯基甘油的情況下，對含磷脂醯絲氨酸膜的表觀膜親和力，還是啟用對磷脂醯絲氨酸的依賴性，都沒有受到共識序列羧基末端保守鹼性殘基去除的影響。

蛋白激酶C家族的絲氨酸/蘇氨酸激酶轉導了大量的細胞外訊號，這些訊號導致了脂類第二信使二醯基甘油的產生。這種脂類允許蛋白激酶C從胞質溶膠轉移到質膜，在那裡它透過與磷脂醯絲氨酸的額外相互作用而被啟用。這是由兩個膜靶向模組介導的：C1和C2結構域。觀察這一過程的方法之一是透過誘變。透過這種方法，PKC BII中Lys 236和Arg 238被突變為丙氨酸。這是利用以pBlueScript為模板的野生型PKC BII進行PCR實現的。

另一種使用的方法是蛋白表達和細胞分級。在這個過程中，編碼野生型或K236A/R238A PKC BII的重組桿狀病毒在Sf-21細胞中孵育4小時，然後用培養基稀釋並在27攝氏度孵育。

另一種使用的方法是表達的蛋白激酶C的Western blot分析。在這種方法中，透過Western blot分析檢測PKC在洗滌劑可溶性和洗滌劑不可溶級分中的分佈。提取物的樣品在SDS-聚丙烯醯胺凝膠上分離，並轉移到聚偏二氟乙烯膜上。

另一種使用的方法是透過脂類觀察，其中使用並製備了蔗糖負載的大單層囊泡，方法是將脂類在氯仿中的混合物在氮氣流下乾燥，然後在真空下抽真空，將脂類懸浮在20 mM HEPES中，pH 7.5，170 mM蔗糖，然後進行5次凍融迴圈，然後使用Liposofast微擠出機擠出。

另一種使用的方法是蛋白激酶C活性測定和蛋白激酶C膜結合測定，其中透過測量其與蔗糖負載的囊泡的結合來確定其膜親和力。透過在相同條件下使用非依賴於輔因子的底物魚精蛋白硫酸鹽，測定上清液和沉澱物中PKC的活性，確定沉澱物的比例。在這種情況下，膜親和力計算為遊離/結合的蛋白激酶C與總脂類濃度的比率。最後，資料分析是另一種用於觀察的技術。在這種技術中，使用一個程式計算遊離鈣，該程式考慮了Mg2+、ATP、Na+、EGTA、EDTA和pH的濃度。

參考文獻：來自加州大學聖地亞哥分校藥理學系和化學與生物化學系的Joanne E. Johnson、Amelia S. Edwards和Alexandra Newton