結構生物化學/聚合酶鏈式反應

PCR 儀/熱迴圈儀

PCR，或聚合酶鏈式反應，是一種可以用來將 DNA 複製許多個數量級或在 DNA 中建立突變的技術。PCR 是生物化學家的一項寶貴技術。例如，它允許我們透過誘導突變來研究基因和 DNA 片段的影響。此外，由於 PCR 可用於擴增極少量的 DNA，因此它是法醫科學家的有用工具。PCR 透過熱迴圈快速擴增 DNA。使用熱迴圈儀，可以透過許多迴圈持續改變溫度。這使得熱迴圈儀能夠解離雙鏈 DNA，使引物與之退火，然後啟用 DNA 聚合酶以複製 DNA。透過多次重複此過程，DNA 以指數方式複製，使我們能夠進一步研究它。

DNA 的 PCR 擴增經歷三個階段

1. DNA 變性：兩個 DNA 鏈透過加熱（94^oC）分離。

2. 寡核苷酸退火：當加熱的 DNA 鏈冷卻時（50-60^oC），兩個互補的寡核苷酸（引物）被新增到每個側翼序列。

3. DNA 聚合：耐熱 DNA 聚合酶催化 5'-3' DNA 合成（70^oC）。

經過 PCR 擴增後，目的基因被限制性內切酶切割並連線到質粒克隆載體。然後將重組質粒置於細菌宿主中並進行繁殖。

除了 DNA 擴增外，PCR 還可以在 DNA 中建立突變和缺失，以及引入限制性內切酶位點。

歷史

前四個 PCR 迴圈的示意圖
1) 在 96°C 下變性。
2) 在 68°C 下退火。
3) 在 72°C 下延伸（P=聚合酶）。

第一個迴圈完成。兩個產生的 DNA 鏈構成下一個迴圈的模板 DNA，因此每個新迴圈複製的 DNA 量增加一倍。

1. 變性

DNA 變性是指加熱雙鏈 DNA 並形成兩個獨立的單鏈。

基本上，這個過程打破了雙螺旋鹼基之間的氫鍵，以克服使鹼基如此緊密堆疊在一起的能量。存在許多變性技術，並且是可能的。最流行和常用的技術是簡單地將 DNA 的溫度提高到其熔點 Tm 以上。然後鹼基對解堆疊，可以使用分光光度法監測。DNA 在 260 奈米處被強烈吸收，並且隨著 DNA 繼續熔化，其吸光度增加，因為單鏈在較高的波長處被吸收，然後一旦完全分離，它就保持不變。這個過程被稱為低熱效應。整個技術可以逆轉，因此 DNA 可以重新自然化一段時間，從而根據時間估計鹼基組成。DNA 變性的主要生物學原因是複製和轉錄。

2. 退火

當溫度降低到 Tm 以下時，分離的互補核酸鏈自發地重新締合形成雙螺旋。這種重組過程稱為退火。對於 PCR 反應，通常的退火時間為 30-45 秒。將此時間增加幾分鐘不會影響 PCR 結果。另一方面，由於聚合酶在 45 到 65o C 之間具有一定的活性降低（大多數退火過程的溫度區間），因此更長的退火時間可能會增加非特異性擴增產物的可能性。退火溫度是 PCR 反應中需要調整的最重要引數之一。此外，此引數的靈活性允許在存在可變數的其他成分（尤其是模板 DNA）的情況下最佳化反應。退火溫度對於查詢和記錄多型性很重要。兩個引物用於擴增 DNA 基因座的兩個序列中的輕微錯配（即使是 1 個鹼基對突變）可以透過退火溫度的輕微變化和/或透過多重 PCR 來檢測。

3. 聚合

聚合是一個流行的過程，這意味著需要能量輸入才能實現它。除了核苷酸外，還需要糖磷酸酯的連線。最後，它需要一種酶，稱為 DNA 聚合酶。三磷酸核苷酸使聚合過程成為可能。這些三磷酸核苷酸在細胞核內自由漂浮，每個 DNA 鹼基都以三磷酸核苷酸的形式存在。三磷酸鍵斷裂釋放的能量為 DNA 聚合提供了能量。

PCR 是 Kary Mullis 在 1983 年提出的一個想法，當時他還是加利福尼亞州伯克利 Cetus 公司的員工。 據穆利斯說，他是在開車時想到這種 DNA 擴增技術的。Cetus 公司看到了這種方法的巨大潛力，並將穆利斯和其他科學家從他們的工作中抽調出來，專門專注於完善 PCR。

這些科學家花了一年的時間研究 PCR，但他們遇到了許多障礙。 其中一個問題是使用最初從大腸桿菌獲得的 DNA 聚合酶。然而，PCR 需要加熱來解離 DNA 鏈，但這種加熱還會使 DNA 聚合酶失活。因此，每次執行都需要新增 DNA 聚合酶，總共需要大量的 DNA 聚合酶才能完成整個聚合酶鏈式反應。然而，從嗜熱菌（Thermus aquaticus）中純化和分離的 Taq 聚合酶的發現導致 PCR 技術的顯著改進，因為 Taq 聚合酶在高溫下穩定，因此實際上消除了在每個迴圈後新增 DNA 聚合酶的需要，並使該技術能夠有效地自動化。

1984 年，使用 Southern 印跡分析了第一次 PCR 的結果，結果表明 PCR 擴增了目標序列。克隆結果也證明 PCR 增加了這種數量，同時在最終結果中仍保持高精度。PCR 專利於 1987 年獲得批准。 1985 年 12 月，Cetus 開始生產商用 PCR 儀器，此後，PCR 開始進入法醫科學領域。1986 年，愛德華·布萊克在“賓夕法尼亞州訴佩斯蒂尼卡斯”一案中使用了 PCR，1989 年，阿萊克·傑弗里斯開始從舊案中擴增 DNA，從而提高了測試的靈敏度，並允許無辜的囚犯獲得自由。

因其對基於 DNA 的化學的貢獻以及對 PCR 技術的開發，Kary Mullis 獲得了 1993 年諾貝爾化學獎。

PCR 的變體

定量即時 PCR (qPCR): 定量 PCR 是一種 PCR 技術，其中 DNA 樣本被同時擴增和定量。一般步驟與原始 PCR 相同，然而，在 qPCR 中，擴增的 DNA 樣本在反應進行時被即時檢測，而在常規 PCR 中，樣本在反應結束時被測量。 qPCR 中使用兩種常見的方法： (1) 使用熒光染料，這些染料與任何雙鏈 DNA 片段結合（例如，EvaGreen 染料 ）和 (2) 特定的熒游標記探針，只有在與互補 DNA 鏈雜交後才能檢測到。對於這兩種方法，測量的熒光增加與 DNA 樣本增加成正比。這種 PCR 方法比常規 PCR 更有效且更精確，因為檢測是即時發生的，不需要在 Southern 印跡上執行樣本的額外時間。qPCR 的應用有很多，包括但不限於癌症和基因異常等核酸疾病的快速診斷。

逆轉錄 PCR (RT-PCR): 逆轉錄 PCR 是一種 PCR 技術，用於擴增、檢測和定量 mRNA。 PCR 首先在開頭進行修改，首先透過逆轉錄酶將 RNA 轉換為 cDNA。反應的這部分可能與 PCR 在同一個試管中進行，也可能不在同一個試管中進行。下一步遵循 PCR，解離雙鏈 cDNA，使引物結合，並激活 DNA 聚合酶以擴增樣本中 DNA 的數量。 與 PCR 一樣，反應產物可以即時檢視，使用 SYBER Green 等熒光染料，或者可以在反應後評估產物。 該反應的效用是擴增給定樣本中 RNA 的數量。此外，由於該反應的產物是編碼蛋白質的基因模板，因此此序列可以插入原核生物中以進行蛋白質生產等。

降落PCR：降落PCR是原始PCR技術的改進，反應最初在退火引物熔化的溫度下進行。在隨後的迴圈中，溫度逐漸降低，每次降低大約1攝氏度，直到達到特定溫度，即降落溫度。 該技術的實用性在於它允許早期積累特異性產物，這些產物隨後作為模板用於後期的PCR擴增，從而降低非特異性PCR產物的生成。

逆向PCR：逆向PCR是原始PCR技術的一種變體，其中已知要擴增的DNA的一個內部序列。原始PCR的一個限制是，它需要與要擴增的DNA的末端序列互補的引物。 然而，該技術的實用性在於，如果只鑑定出一個位點，那麼仍然可以進行PCR。這可以透過用限制性內切酶消化DNA的末端，並用DNA連線酶連線DNA的兩個自由末端來實現，從而產生一個環狀DNA。然後，用另一種限制性內切酶切割已知的內部序列，從而產生一條DNA鏈，其末端序列已知，這使得可以透過PCR擴增目標序列。

解旋酶依賴性擴增 (HDA)：解旋酶依賴性擴增是一種類似於PCR的方法。然而，HDA的不同之處在於它依賴於解旋酶來分離DNA，而不是加熱DNA使其變性。因此，它是一種在恆定溫度下進行的PCR方法。 因此，方法類似，解旋酶將雙鏈DNA分離成單鏈，引物與之退火，然後擴增DNA。該技術的實用性在於它幾乎可以在任何地方進行，例如在犯罪現場，而PCR只能在實驗室環境中進行，因為它需要大型、昂貴、笨重的機器。 然而，儘管有這些積極的品質，HDA的使用並不像PCR那樣廣泛，因為大多數這類反應，無論是來自犯罪現場還是醫院，通常都在實驗室進行。此外，HDA的樣本量不及PCR，而且HDA相對比PCR更昂貴。

巢狀PCR：巢狀PCR是PCR的一種變體，用於最大程度地減少引物結合到DNA序列中錯誤位置併產生汙染的結果。該反應首先用一對引物進行，這些引物與DNA的不同位置結合，但重要的是它們結合在要擴增的感興趣序列的外部。 在第二個迴圈中，使用另一對引物結合到第一對引物內部的特定DNA序列上，並擴增該序列。該技術的原理是，如果一個隨機序列被第一對引物意外擴增，那麼第一對引物之間的內部序列被第二對引物擴增的機率非常低，從而有效地最大程度地減少了副反應的汙染。

應用

檢測進化關係：PCR可用於擴增化石中發現的少量DNA。這種擴增的DNA可以被測序。使用生物資訊學中的技術，這種新測序的DNA可以與其他古代生物以及現代生物進行相似性測試。這些比較揭示了古代物種是哪些現代物種的共同祖先，以及它與哪些其他古代物種密切相關。PCR消除了生物資訊學只分析現代生物DNA的限制，並使遠距離進化關係更容易識別。

檢測癌細胞的存在：如果無法確定組織樣本中是否存在癌細胞的痕跡，可以從樣本中分離並純化DNA。可以對純化的DNA進行PCR。擴增的DNA更容易檢測到已知會導致癌症的某些突變（在生長基因中）。這不是檢測癌症的萬無一失的方法（一些癌細胞可能沒有任何“致癌突變”清單），但關鍵是PCR使在樣本量過小時，檢測突變的存在成為可能。

受害者血液在嫌疑人衣服上 = 有罪！！（可能）

法醫：從犯罪現場某個地方獲得的少量DNA（例如嫌疑人衣服上的血跡）可以用PCR擴增，並與受害者和嫌疑人的DNA進行比較。一滴血或一根頭髮的片段可能沒有足夠的DNA進行檢測，但PCR使檢測這種少量DNA成為可能。對DNA進行測序過於繁瑣，因此使用限制性內切酶來建立DNA指紋。將DNA樣本置於一種或多種限制性內切酶中，持續一定時間。限制性內切酶在它們的識別序列處切割DNA，但不是在所有識別序列處切割（如果時間更長，它們就會切割）。如果DNA不同，酶會切割不同長度的DNA，如果DNA相同，酶會切割兩個樣本中相同長度的DNA。將每個樣本的DNA片段透過凝膠，並進行比較。這可以提供強有力證據，證明嫌疑人是無罪的還是有罪的。