結構生物化學/多核苷酸激酶/磷酸酶酶
在生物體中，最常見的問題之一是細胞 DNA 損傷，即突變。突變非常普遍，與生命中各種重要的因素有關，例如癌症治療、神經系統疾病和衰老。DNA 損傷的基本原理是，內部和外部因素導致鹼基丟失，從而導致 DNA 鏈斷裂。在修復鏈斷裂之前，斷裂的末端需要進行處理，才能正確地替換缺失的鹼基。這就是多核苷酸激酶/磷酸酶 (PNKP) 發揮作用的地方，它透過催化 5'-磷酸和 3'-羥基末端的恢復來發揮作用。PNKP 與各種其他蛋白質相互作用，特別是 XRCC1 和 XRCC4，並利用不同的途徑修復 DNA。PNKP 的 5' 激酶和 3' 磷酸酶活性處理或修復 DNA 中的單鏈和雙鏈末端。瞭解其機制為治療疾病和癌症提供了機會。已知 PNKP 抑制劑會使細胞對 IR 和化療藥物敏感，因為它們阻止 PNKP 處理 DNA 修復。PNKP 在 DNA 鏈斷裂修復中的作用遵循三種主要的 DNA 修復途徑：單鏈斷裂修復 (SSBR)、鹼基切除修復 (BER) 和雙鏈斷裂修復 (DSBR)。這三種機制可以提供有關其他蛋白質如何結合和與 PNKP 酶反應的有用資訊。[1]
PNKP 是一種多結構域酶，由兩個主要結構域組成：N 端叉頭相關 (FHA) 結構域和 C 端催化結構域。此外，C 端催化結構域由融合的磷酸酶和激酶亞結構域組成。兩個主要結構域，FHA 和催化結構域，透過一個靈活的多肽段連線。正是這種連線部位使 PNKP 能夠結合其他蛋白質的 CK2 磷酸化區域。多核苷酸激酶磷酸酶和噬菌體 T4 多核苷酸激酶（一種克隆酶）的不同之處在於，T4 酶不包含 FHA 結構域，而 PNKP 在 N 端包含 FHA 結構域。然而，T4 多核苷酸激酶的激酶亞結構域位於 N 端，而不是 C 端催化結構域。 [1] PNKP 相互作用的兩種特定蛋白質被稱為 XRCC1 和 XRCC4。XRCC1 和 XRCC4 的主要區別在於 XRCC1 修復 DNA 單鏈斷裂，而 XRCC4 蛋白修復 DNA 雙鏈斷裂。 [1] 只有 FHA 結構域能夠結合這些蛋白質中 CK2 特異性磷酸化的區域。對於 XRCC1，CK2 的聚集區域通常位於 515 到 526 殘基之間，這是 XRCC1 結合 FHA 和修復 DNA 所必需的。相反，XRCC2 僅需要一個主要的 CK2 位點。此外，aprataxin 和 aprataxin 以及 PNKP 樣因子 (APLF) 有助於 DNA 修復；這兩個 DNA 修復因子也具有 FHA 結構域。 [1]
PNKP 還包含兩個催化活性位點，位於酶的同一側，以及獨立的 ATP 和 DNA 結合位點。噬菌體和哺乳動物酶之間的不同 DNA 結合位點有很大差異。對於噬菌體酶，結合位點透過一個狹窄的通道發生，該通道通向催化天冬氨酸殘基，這僅有助於單鏈修復。至於哺乳動物酶，它們磷酸化 5'-羥基末端，修復雙鏈的效率高於單鏈。
具體來說，對於 IR 誘導的鏈斷裂，核苷酸的丟失是透過一個過程修復的，該過程由聚（ADP 核糖）聚合酶 (PARP)、XRCC1 和 AP 核酸內切酶 I (APE1) 完成。這個過程可以使用短片段完成，使用 DNA 聚合酶和 DNA 連線酶 III。它也可以使用長片段完成，使用 DNA 聚合酶、連線酶 I 和 FEN1 核酸內切酶。APE1 的作用是去除 3'-磷酸甘油酸。PNKP 本身在 3'-磷酸基團中執行水解，同時保持 5'-OH 磷酸化，這比 APE1 的活性強得多。總的磷酸酶活性明顯高於激酶活性，導致磷酸酶缺陷型 PNKP 的過表達。
SSBR 的基本機制是
- 斷裂由 PARP 識別
- 識別僅吸引 XRCC1，XRCC1 通常與 DNA 連線酶結合
- XRCC1 招募 PNKP/APE1
- 招募的酶恢復末端，使 DNA 聚合酶能夠新增缺失的核苷酸，並使 DNA 連線酶能夠結合斷裂的鏈。
處於壓力或損傷狀態的細胞確實需要 CK2 磷酸化的 XRCC1 結合 PNKP 的 FHA 結構域，以便進行修復。非壓力細胞能夠應付非磷酸化蛋白質，因為修復沒有迫切需要。
雙鏈斷裂修復途徑依賴於蛋白質 XRCC4，XRCC4 在磷酸化後不會刺激酶 PNKP；相反，非磷酸化 XRCC4 會啟用 PNKP。然而，磷酸化 XRCC4 與 DNA 連線酶 IV 的組合可以透過促進 PNKP 的 FHA 結構域與磷酸化 XRCC4 蛋白之間的結合來觸發 PNKP。 [1] PNKP 僅參與 DSBR 的非同源末端連線 (NHEJ) 途徑，但不參與同源重組。該機制類似於 SSBR，不同之處在於 PNKP 的激酶活性是連線發生所必需的。此外，磷酸化實際上依賴於 XRCC4，而不是 XRCC1，以便將 PNKP 結合到 DNA 連線酶，從而刺激 DNA 連線酶。還應該注意的是，XRCC4 是 IR 或化療處理後細胞存活所必需的。關於 DSBR 最重要和最獨特的事實是，磷酸化 XRCC4 實際上無法透過 FHA 結構域與 PNKP 結合，從而抑制細胞修復。然而，新增 DNA 連線酶可以逆轉這種抑制，因此可以成功地進行 DNA 修復。
DSBR 的非磷酸化 XRCC4 的作用方式類似於單鏈斷裂修復 (SSBR) 中的 XRCC1，因為它們都鼓勵多核苷酸激酶/磷酸酶 (PNKP) 的酶促細胞週轉。雖然非磷酸化 XRCC4 對 PNKP 的 T 末端叉頭相關 (FHA) 結構域具有吸引力，但磷酸化 XRCC4 具有更大的吸引力，這更有利於 DNA 雙鏈修復。總之，非磷酸化和磷酸化 XRCC4 與 DNA 連線酶和 PNKP 共同以一種複雜的方式協同工作，以修復 DNA 末端。
由電離輻射、活性氧和烷化劑引起的多數次要鹼基修飾的修復是透過鹼基切除修復 (BER) 過程進行的。該過程的第一步涉及 DNA 糖基化酶及其去除修飾的鹼基。然後，透過 AP 核酸內切酶 I (APE1) 在新形成的脫嘌呤/脫嘧啶 (AP) 位點切割 DNA。當發現 nei 核酸內切酶 VIII 樣 1 (NEIL1) 和 NEIL2 哺乳動物 DNA 糖基化酶時，PNKP 的存在及其在 BER 途徑中的作用變得明朗，這些蛋白質有助於誘導 3'-磷酸末端。NEIL 1 和 NEIL 2（分別為 nei 核酸內切酶 VII 樣 1 和 2）可以形成包含 PNKP 或其他 BER 成分的複合物。NEIL 1 和 NEIL 2 透過切除或切除受損的 DNA 鹼基，然後去除錯誤來修復 DNA。NEIL 糖基化酶之間的競爭可能導致不依賴於 APE1（AP 核酸內切酶 1）的鹼基切除修復途徑。 [1] 這兩種新發現的蛋白質，雖然被發現不直接與 PNKP 結合，但被發現與 BER 過程的更大組分相關，其中包括 PNKP。這些糖基化酶能夠切割非鹼基對位點，並導致 PNKP 耗盡的細胞對甲基甲磺酸 (MMS)（一種烷化劑）敏感。PNKP 在 BER 中的確切功能尚不清楚，但透過更深入地研究 NEIL1 和 NEIL2，這些蛋白質可能提供有關 PNKP 在這種修復途徑中的作用和功能的解釋。
透過PKNP複雜的結構，我們可以瞭解到它在修復受損的鬆散DNA鏈方面的複雜功能。PKNP在人類臨床研究中可以發揮的創新作用之一是，它可以幫助細胞抵抗輻射損傷，這在癌症化療的臨床領域中可能會有益。由於PKNP在腫瘤細胞重建中的作用，近年來，許多PKNP抑制劑以及其他DNA修復蛋白抑制劑引起了人們的興趣，目的是使腫瘤和癌細胞更容易受到輻射攻擊。當這些惡性細胞變得更加脆弱時，放射治療的效果會更加顯著，患者體內的癌症更有可能緩解。抑制劑可能對抗的癌症型別包括卵巢癌和結腸癌，這兩種癌症比較常見。雖然PKNP修復DNA的作用對正常細胞非常有益，但DNA修復抑制酶的相反作用在試圖根除癌症和腫瘤細胞時也是有幫助的。
當PKNP（非同源末端連線、單鏈斷裂修復和鹼基切除修復）中的一條或多條途徑發生突變或功能中斷時，與人類嚴重的腦神經疾病相關，這對正常發育有害。例如，酶LIG4的突變與小頭畸形相關，小頭畸形是一種嬰兒出生時頭圍比正常或自然狀態小得多的疾病。在小鼠中，當酶XRCC1（必須先磷酸化，然後與PKNP的FHA結構域結合）被刪除時，會導致癲癇。一項最新研究發現，常染色體隱性小頭畸形、嬰兒期發作性癲癇和發育遲緩（MCSZ）是由PKNP酶兩個結構域的突變引起的。由於突變組合可能來自磷酸酶或激酶結構域，甚至兩者都有，因此受影響個體的許多症狀也有所不同。透過MCSZ的各種症狀，表明PKNP可以透過多種酶修復途徑（DSBR、SSBR和BER）發揮作用。
PKNP的突變會導致常染色體隱性神經系統疾病，因此PKNP水平升高可以修復活性氧（ROS）的影響，活性氧是含有氧分子的自由基，會導致體內DNA、蛋白質和脂質氧化。鎘和銅水平的升高會造成損害和神經毒性，從而導致PKNP抑制，而PKNP是修復人類細胞中DNA鏈斷裂的酶，因此增加了患癌的可能性。[1] 另外兩項研究表明，PKNP可以被自然存在的鎘和銅含量變性。從生理角度來看，鎘和銅實際上具有有害的致癌和神經毒性作用，這似乎與PKNP的功能相矛盾。鎘和銅的積累會阻止PKNP正常發揮作用，因此當細胞無法修復DNA鏈斷裂或修復錯誤時，通常會導致癌症。[1]