結構生物化學/RNA 聚合酶 II
雖然人們普遍認為轉錄調控發生在基因編碼區的鄰近區域，主要是透過啟動子和增強子，並且聚合酶充當快速“讀取基因”的機器，但最近的證據表明，這個過程遠不止如此。
轉錄延伸非常複雜且受到高度調控，這個過程意義重大，因為它會影響基因組的組織和完整性。本文將探討 RNA 聚合酶 II 轉錄延伸的一些錯綜複雜之處，這些在一段時間內被忽略了。
RNA 聚合酶 II 轉錄迴圈可以分為幾個不同的步驟
- RNAPII 被募集到基因的啟動子區域，在那裡它與通用轉錄因子形成預起始複合物
- 此時，起始開始，啟動子在稱為“啟動子清除”的過程中被留下
- RNAPII 進入進行性轉錄延伸，基因被完全轉錄
- 然後，轉錄終止發生，導致 RNAPII 釋放和迴圈利用
RNAPII 面臨的挑戰
- 聚合酶需要逃脫啟動子
- 前 mRNA 轉錄本的產生需要與 RNA 生物合成緊密耦合。這包括 RNA 加帽、剪接、轉錄本切割和聚腺苷酸化。
- RNAPII 必須在染色質中繞過核小體和其他障礙（如 DNA 損傷），因為轉錄延伸發生在染色質中
- 轉錄受 DNA 代謝過程的影響：DNA 修復、重組和複製。
- 高度轉錄基因中的轉錄延伸由幾個聚合酶分子同時進行，因此必須調節基因“流量”。
這種機制控制著轉錄延伸。它涉及透過正確傳入核苷酸的結合和水解來穩定正向轉運狀態。這種機制的問題是，儘管它快速向前移動，但也可能向後移動。因此，即使形成了新的磷酸二酯鍵，酶也可以回溯一個或多個核苷酸，從而使新形成的 3' 末端與活性位點錯位。布朗運動可以使 RNA 與活性位點重新對齊。通用延伸因子會影響不同酶狀態之間的多個平衡，這有助於推動反應朝著正向轉運方向進行。
轉錄保真度至關重要，因為在延伸過程中將正確的核苷酸插入 RNA 轉錄本對於基因表達的準確性至關重要。
RNA 聚合酶 II 有幾個關鍵結構，可以確保保真度
- 觸發環
- Rpb9（RNAPII 上的亞基）
- 轉錄因子，尤其是被稱為 TFIIS 的轉錄因子
- RNA 聚合酶 II 本身
觸發環位於活性位點下方，參與與傳入核苷酸的多個相互作用。觸發環在保真度中起著關鍵作用，活性位點中的錯配核苷酸無法與環正確對齊，因此導致磷酸二酯鍵形成速率大大降低。因此，觸發環以這種方式介導磷酸二酯鍵形成。觸發環區分 dNTP 和 rNTP 鹼基，並與 2'OH 相互作用。
RNAPII 上的另一個重要結構是 Rpb9 亞基，它最初是由研究酵母菌株的科學家發現的。Rpb9 會延遲傳入核苷酸上觸發環的閉合，這有助於透過為修復錯誤提供更多時間來確保轉錄保真度。
RNAPII 本身在其自身的轉錄保真度中起著關鍵作用，因為這種聚合酶可以在它轉錄的分子上向前和向後移動，因此可以透過錯誤摻入的核苷酸的轉錄本切割來糾正任何錯誤。轉錄因子被稱為 TFIIS，它極大地增強了轉錄本切割。最近的研究還表明，TFIIS 在保真度過程中也發揮作用，因為它們與 Rpb9 的功能緊密耦合，這讓我們相信 Rpb9 可能在核苷酸新增之前和之後透過影響觸發環的功能以及透過介導 TFIIS 功能來參與 RNAPII 保真度。
轉錄延伸發生在染色質模板上，染色質是對轉錄過程極其抑制的模板。因此，必須利用某些機制來使它成為一個更適合轉錄發生的友好場所。這涉及核小體的暫時位移和修飾/解體。這可以通過幾種不同的機制發生，並且需要；
- 組蛋白伴侶
- 染色質重塑因子
- 組蛋白修飾酶
這些相同的因子也有助於在 RNAPII 轉錄後重置染色質結構。
首先，H3-H4 二聚體被 HAT1-RbAp48 複合物乙醯化。然後，大多數 H3 和 H4 蛋白被傳遞給 Asf1、CAF-1、yRtt106 和 HIRA，以介導染色質組裝。CAF-1、yRtt106 和 HIRA 之間的選擇取決於 H3 的變體。例如，H3.1 靶向 CAF-1，而 H3.3 靶向 HIRA。CAF-1 和 yRtt106 與 DNA 合成相關聯，而 HIRA 發生在 DNA 合成之外。組蛋白傳遞給不同的組蛋白伴侶取決於特定的乙醯化標記 H3 K56Ac。H3 K56Ac 在酵母中的作用是在 DNA 修復和複製期間驅動染色質組裝。然而，由於 H3 K56Ac 在人類中更難檢測，因此僅推測它將執行相同的任務。對於 H3 K56Ac，Asf1 將組蛋白傳遞給 CAF-1 或 Rtt106 的可能性更高。DNA 合成依賴性途徑或合成獨立性途徑的選擇取決於伴侶之間的物理相互作用。傳遞中的最後一個伴侶將組蛋白放置在 DNA 上。有用於放置組蛋白的 DNA 位置的機制，以及用於增加組蛋白濃度的機制。 [1]
其中一個機制是延伸的RNAPII前方的核小體解體；某些實驗證明了這是一個機制。一個這樣的實驗測量了酵母GAL基因的組蛋白密度，結果表明基因啟用會導致啟動子和編碼區核心小體的丟失。這種組蛋白密度的丟失是由延伸的RNAPII引起的。對酵母中核小體佔有率的全基因組分析表明，轉錄速率和組蛋白密度呈負相關，進一步證明了核小體在轉錄過程中被解體。另一個機制是在轉錄過程中所有核心組蛋白的置換。然而，存在不同型別的二聚體。H2A/H2B二聚體定位在核小體的外部，並且具有較少的蛋白質-DNA接觸。這些二聚體響應轉錄因子而快速交換。相反，組蛋白H3和H4的移動性要小得多，它們的週轉率與H2A/H2B二聚體完全無關。因此，雖然在此過程中所有核心組蛋白都被置換，但H2A/H2B組蛋白更容易移動，而H3/H4則不會。
就像核小體組裝過程以逐步的方式發生，並伴隨著組蛋白伴侶一樣，核小體解體過程也是一個逆向的逐步過程。核小體組裝和解體之間最顯著的區別在於，核小體解體需要能量。能量是用來破壞組蛋白-DNA鍵，以便組蛋白伴侶可以與組蛋白結合並將其從DNA上移開。在進行解體之前需要考慮的因素是組蛋白的翻譯後修飾和組蛋白伴侶的可用性。這是一個平衡問題。如果只有H2A-H2B的平衡偏向於從DNA上移除，那麼就只會發生組蛋白交換。但是，如果H3-H4的平衡偏向於從DNA上移除，那麼就會發生核小體解體。啟動子區域的H3 K56Ac是核小體解體中一個常見的例子，因為它使H3-H4的平衡偏向於從DNA上移除。這種平衡受到所有相互作用的影響，包括組蛋白-組蛋白伴侶相互作用、組蛋白-DNA相互作用或組蛋白-組蛋白相互作用。[1]
組蛋白伴侶
[edit | edit source]組蛋白伴侶是參與細胞內組蛋白動力學的組蛋白結合蛋白，最近的證據表明，一種被稱為FACT的組蛋白伴侶在轉錄延伸中起著巨大的作用。FACT（促進染色質轉錄）是一種組蛋白伴侶，它透過破壞核小體結構來促進延伸，以便在RNAPII透過時移除H2A/H2B二聚體。Spt6是一種H3和H4組蛋白伴侶，它維持染色質結構，促進在RNAPII轉錄延伸之後恢復正常的染色質結構。總的來說，組蛋白伴侶參與了轉錄延伸過程中組蛋白的移除和重新沉積。
組蛋白伴侶作為蛋白質不僅將組蛋白和DNA包裝到核小體結構中，而且還解體這種結構。組蛋白和DNA在核小體中以某些方式摺疊在一起，組蛋白伴侶幫助監督每一步。H2A、H2B、H3和H4是組蛋白。組蛋白伴侶協助從DNA上形成H3-H4異四聚體的四聚體。四聚體與H2A-H2B二聚體結合形成核小體。組蛋白伴侶非常重要，因為如果沒有它們的幫助，帶正電的組蛋白會與帶負電的DNA形成聚集體。組蛋白具有疏水部分和輕微酸性部分的事實使得該蛋白質更容易被DNA吸引。組蛋白伴侶雖然在序列上不相似，但可以在結構上分為β-摺疊夾心伴侶、α-耳罩伴侶、β-螺旋槳伴侶以及β-桶和半桶伴侶。[1]
β-摺疊夾心伴侶
這種結構的特徵是釀酒酵母Asf1的N端核心域，並且沒有酸性尾巴。透過誘變和NMR化學位移證實，組蛋白結合發生在Asf1的疏水和酸性表面。H4的C端尾巴可以與yAsf1β-摺疊或H2A微型β-摺疊結合。因此，yAsfi可以進入H3-H4二聚體並形成結構上保守的複合物。人類ASF1a的晶體結構揭示了這種複合物。Asf1將H3-H4二聚體傳遞給其他組蛋白伴侶，如CAF-1或HIRA。Asf1調節轉錄、複製和修復。除了Asf1，Yaf9是β-摺疊夾心伴侶中的另一種伴侶。Yaf9在H2AZ乙醯化和沉積到常染色質啟動子區域中起作用。它還包含結構上保守的特徵，這些特徵可以作為H3-H4結合位點並調節轉錄。[1]
α-耳罩伴侶
該組負責將組蛋白從細胞質中傳遞、與H1結合以及組裝和解體核小體。這些伴侶的特點是它們使用長α-螺旋進行二聚化並連線αβ耳罩基序。誘變證實了組蛋白結合位點位於耳罩域的中央和底部表面。Vps75是該組中的一種伴侶，它與H3-H4二聚體結合。它參與H3 K56的乙醯化，進而幫助包裝過程。除了乙醯化，Vps75還負責調節轉錄、修復和維持端粒長度。在Vps75中，耳罩域比NAP1更靠近。NAP1負責轉錄、H2AZ交換、連線子組蛋白沉積和組蛋白傳遞。[1]
β-螺旋槳伴侶
該組的特徵是酸性區域，這些區域不像其他伴侶那樣明顯。核質蛋白負責調節核仁事件以及在諸如卵子發生、精子染色質解壓縮和核小體組裝等事件期間的組蛋白儲存。核質蛋白的五聚體N端具有自組裝成十聚體的能力。核質蛋白核心與連線子組蛋白和核心組蛋白協同工作，產生五個組蛋白八聚體。除了具有β-螺旋槳伴侶結構，CAF-1和RbAp46在N端有一個α-螺旋。這些伴侶在頂部帶負電，在底部帶疏水性。H4α-螺旋在伴侶的α-螺旋和酸性區域的結合環之間結合。因此，H3-H4二聚體結構被破壞。為了抵消這種情況，這些伴侶承擔著將H3-H4二聚體與幾個染色質修飾複合物（如HAT1、PRC2、NURD和NURF）結合在一起的角色。[1]
β-桶和半桶伴侶
這個家族包括FACT亞基Spt16、Pob3、Nhp6、SPT16和SSRP1。FACT這個詞基本上意味著這些伴侶促進染色質轉錄。Pob3的結構包括一個螺旋蓋的β-桶，這有助於它與酵母複製蛋白A（RPA）複合物結合，以協助複製。Spt16具有連線的氨基肽酶和皮塔麵包域。Rtt106與H3 K56上乙醯化的組蛋白結合。它的H3-H4結合位點位於C端域的一個環中。[1]
組蛋白變體伴侶Chz1
該組蛋白伴侶組的特點是沒有定義的序列或結構。Chz1是一種H2AZ-H2B結合蛋白。NMR證實了Chz1的獨特結構，即α-螺旋，它們主要與H2AZ-H2B二聚體的一個表面結合，具有高親和力。因此，它的解離速度比它的結合速度慢。[1]
組蛋白伴侶的寡聚狀態取決於核小體組裝的階段。組蛋白伴侶-組蛋白結合可以是簡單的，也可以是多聚體的。弱的單個結合累積起來形成高親和力的多聚體結合。雖然Asf1和Chz1都是單體的，但它們在核小體組裝中發揮不同的作用。Asf1阻止H3-H4四聚體形成。H3通常會在組蛋白八聚體內部二聚化，但Asf1與H3結合，使其暴露於其他組蛋白伴侶。一旦Asf1釋放，H3-H4四聚體就可以與連線的Rtt106和CAF1一起形成。在這個階段之後，四聚體沉積到DNA上。另一方面，Chz1與H2AZ-H2B的已經暴露的組蛋白八聚體表面結合。因此，組蛋白直接沉積到四聚體上。[1]
- αβ耳罩伴侶在體外組裝核小體。NAP1不僅組裝組蛋白八聚體，而且還組裝四聚體。NAP1透過H2A-H2B或
H2AZ-H2B組裝組蛋白八聚體。NAP1透過H3-H4和DNA組裝組蛋白四聚體。當週圍有H2A-H2B時，這個過程就不那麼有利了。Vps75不同於NAP1，它對H3-H4更特異，對其他組蛋白的親和力更弱。NAP1透過一個表面與所有具有共同組蛋白摺疊的組蛋白結合。這也是它與FACT不同的點，因為FACT與多個組蛋白的多個表面結合。FACT在體外和體內執行不同的功能。在體外，FACT去除H2A-H2B二聚體。然而，在體內，FACT在轉錄延伸、修復和複製過程中將H2A-H2B二聚體放到DNA上。[1]
- dCAF-1 p55和hCAF-1 RbAp48亞基中只有一個H4結合位點，但有多個H3結合位點。H4的單一結合位點位於H3-H4的相反面
二聚體。這使得CAF-1亞基能夠到達與ASf1結合的組蛋白二聚體或沉積到DNA上的組蛋白四聚體。
- Np組裝成五聚體的二聚體。這些組蛋白伴侶的每個面都可以結合一個八聚體。Np與H2A-H2B二聚體結合，N1與H3-H4四聚體結合形成八聚體。NASP，
核自身抗原精子蛋白，與 H3/H4 結合並幫助核小體組裝過程。[1]
組蛋白伴侶引導的摺疊途徑
組蛋白伴侶在引導組蛋白-DNA 摺疊過程中極其重要，因為如果沒有它，組蛋白會形成充當動力學陷阱的中間體。核小體組裝是一個能量有利的過程，為了保持這種方式，組蛋白伴侶需要防止這些阻止組蛋白與 DNA 結合的動力學陷阱。這些動力學陷阱能量低，組蛋白從這些動力學陷阱中出來並結合在 DNA 上在能量上不利，因為它在這些中間體中更穩定。組蛋白伴侶使組蛋白-DNA 複合物以最穩定和低能量的方式摺疊。到達 DNA 動力學陷阱是一個能量下降的過程，途徑中的能量更低，所以如果沒有組蛋白伴侶的幫助，組蛋白就會卡在該中間體中，永遠無法到達目的地。組蛋白伴侶與 ATP 依賴性染色質重塑體協同工作。在動力學陷阱中，它們有助於將組蛋白帶回正確的途徑。由於動力學陷阱的能量較低，染色質重塑體透過提高其能量將這些中間體清除。這些染色質重塑體在破壞組蛋白-DNA 鍵方面也很有用。組蛋白上的某些乙醯化標記或增加或降低結合親和力，並根據核小體是否需要經歷組裝或分解來移除。 [1]
ATP 依賴性染色質重塑複合物（重塑體）利用 ATP 的能量來改變染色質的結構。
重塑體主要有四個家族
- SWI-SNF
- ISWI
- CHD
- INO80/SWR
一個被稱為 RSC 的 SWI-SNF 重塑體可以在一個簡單的重構染色質轉錄系統中透過單核小體刺激 RNA 聚合酶 II 轉錄延伸。組蛋白乙醯化會增強這一點，因為它會增加 RSC 對核小體的親和力。重塑體 Chd1 與活躍轉錄位點的染色質相關聯，並且它也參與轉錄延伸，因為它與延伸因子 Paf、DSIF 和 FACT 相互作用。
組蛋白的共價修飾是另一種改變染色質結構的方式，它不涉及組蛋白的去除和替換。相反，它透過影響核小體間的接觸或改變靜電荷來改變染色質的包裝。以及使用共價連線的基團作為延伸相關效應複合物的結合表面。
上述可以透過以下三種機制實現
- 組蛋白乙醯化
- 組蛋白甲基化
- 組蛋白泛素化
Selth，Luke A. Sigurdsson，Stefan。Svejstrup，Jesper Q。“RNA 聚合酶 II 的轉錄延伸”。生物化學年度評論 2010 年。第 79 卷：271-293。2010 年 4 月 1 日。DOI：10.1146/annurev.biochem.78.062807.091425